Дархлаа зохицуулах метаболитууд нь хавдрын бичил орчны (TME) гол шинж чанар боловч цөөн хэдэн үл хамаарах зүйлээс бусад тохиолдолд тэдгээрийн мөн чанар нь бараг тодорхойгүй хэвээр байна. Энд бид эдгээр өөр өөр TME хэсгүүдийн метаболомыг илрүүлэхийн тулд өндөр зэрэглэлийн сероз хавдар (HGSC)-тай өвчтөнүүдийн хавдар болон асцитаас хавдар болон Т эсүүдийг шинжилсэн. Асцит болон хавдрын эсүүд нь метаболитын өргөн ялгаатай байдаг. Асциттай харьцуулахад хавдрын нэвчсэн Т эсүүд нь 1-метилникотинамид (MNA)-аар мэдэгдэхүйц баялаг байдаг. Т эсүүд дэх MNA-ийн түвшин өндөр байгаа ч никотинамид N-метилтрансфераза (S-аденозилметиониноос никотинамид руу метил бүлгийг шилжүүлэхийг хурдасгадаг фермент)-ийн илэрхийлэл нь фибробласт болон хавдрын эсүүдээр хязгаарлагддаг. Үйл ажиллагааны хувьд MNA нь Т эсүүдийг хавдар үүсгэдэг цитокины хавдрын үхжилийн хүчин зүйл альфаг ялгаруулдаг. Тиймээс TME-ээс гаралтай MNA нь Т эсүүдийн дархлааны зохицуулалтад хувь нэмэр оруулж, хүний ​​хорт хавдрыг эмчлэх дархлаа эмчилгээний боломжит зорилтыг илэрхийлдэг.
Хавдрын гаралтай метаболитууд нь хавдрын эсрэг дархлаанд гүн гүнзгий дарангуйлах нөлөө үзүүлдэг бөгөөд улам олон нотолгоо нь тэдгээр нь өвчний явцыг өдөөх гол хөдөлгөгч хүч болж чаддаг болохыг харуулж байна (1). Варбургийн нөлөөнөөс гадна хавдрын эсийн бодисын солилцооны төлөв байдал болон хавдрын бичил орчны (TME) дархлааны төлөв байдалтай хэрхэн холбогддогийг тодорхойлох сүүлийн үеийн судалгаанууд эхэлсэн. Хулганы загвар болон хүний ​​Т эсүүдийн судалгаагаар глутамины солилцоо (2), исэлдэлтийн солилцоо (3) болон глюкозын солилцоо (4) нь дархлааны эсийн янз бүрийн дэд бүлгүүдэд бие даан үйлчилж чаддаг болохыг харуулсан. Эдгээр зам дахь хэд хэдэн метаболитууд нь Т эсийн хавдрын эсрэг үйл ажиллагааг дарангуйлдаг. Коэнзим тетрагидробиоптерин (BH4)-ийг блоклох нь Т эсийн үржлийг гэмтээж, бие махбодид BH4-ийн өсөлт нь CD4 болон CD8-ээр зуучлагддаг хавдрын эсрэг дархлааны хариу урвалыг сайжруулж чаддаг болох нь батлагдсан. Үүнээс гадна кинуренины дархлаа дарангуйлах нөлөөг BH4-ийг хэрэглэснээр аварч болно (5). Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутант глиобластомын үед энантиометаболик (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG)-ийн шүүрэл нь Т эсийн идэвхжил, тархалт болон цитолизийн идэвхийг дарангуйлдаг (6). Саяхан гликолизийн дайвар бүтээгдэхүүн болох метилглиоксал нь миелоид гаралтай дарангуйлагч эсүүдээр үүсгэгддэг бөгөөд метилглиоксалыг Т эсийн дамжуулалт нь эффектор Т эсийн үйл ажиллагааг дарангуйлдаг болохыг харуулсан. Эмчилгээнд метилглиоксалыг саармагжуулах нь миелоид гаралтай дарангуйлагч эсийн (MDSC) идэвхийг даван туулж, хулганы загварт хяналтын цэгийн хоригийн эмчилгээг синергетик байдлаар сайжруулж чадна (7). Эдгээр судалгаанууд нь TME-ээс гаралтай метаболитуудын Т эсийн үйл ажиллагаа, идэвхийг зохицуулахад гол үүргийг онцолж байна.
Т эсийн үйл ажиллагааны алдагдал өндгөвчний хорт хавдрын үед өргөн тархсан мэдээлэгдсэн (8). Энэ нь гипокси болон хавдрын судасны хэвийн бус бүтцийн төрөлхийн бодисын солилцооны шинж чанартай холбоотой (9) бөгөөд энэ нь глюкоз болон триптофаныг сүүн хүчил, кинуренин зэрэг дайвар бүтээгдэхүүн болгон хувиргахад хүргэдэг. Эсийн гаднах лактат хэт их байх нь интерферон-γ (IFN-γ)-ийн үйлдвэрлэлийг бууруулж, миелосупрессив дэд бүлгүүдийн ялгаралтыг өдөөдөг (10, 11). Триптофаны хэрэглээ нь Т эсийн үржлийг шууд дарангуйлж, Т эсийн рецепторын дохиоллыг дарангуйлдаг (12-14). Эдгээр ажиглалтаас үл хамааран дархлааны бодисын солилцооны талаар in vitro Т эсийн өсгөвөрт оновчтой орчин ашиглан хийсэн эсвэл in vivo гомолог хулганы загвараар хязгаарлагдсан бөгөөд эдгээрийн аль нь ч хүний ​​хорт хавдар болон физиологийн макро болон микро орчны олон янз байдлыг бүрэн тусгаагүй болно.
Өндгөвчний хорт хавдрын нийтлэг шинж чанар нь хэвлийн хөндийн тархалт ба асцит үүсэх явдал юм. Асцитад эсийн шингэн хуримтлагдах нь өвчний явц даамжирсан байдал болон тавилан муутай холбоотой байдаг (15). Мэдээллийн дагуу энэхүү өвөрмөц хэсэг нь гипоксик, судасны эндотелийн өсөлтийн хүчин зүйл (VEGF) болон индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO)-ийн өндөр түвшинтэй бөгөөд Т зохицуулагч эсүүд болон миелоид дарангуйлагч эсүүдээр нэвчдэг (15-18). Асцитын бодисын солилцооны орчин нь хавдрын өөрийнхээс өөр байж болох тул хэвлийн хөндийн Т эсүүдийг дахин програмчлах нь тодорхойгүй байна. Үүнээс гадна, хавдрын орчинд байдаг асцит ба метаболитуудын хоорондох гол ялгаа, олон янз байдал нь дархлааны эсүүдийн нэвчилт болон тэдгээрийн хавдар дээрх үйл ажиллагаанд саад учруулж болзошгүй тул цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна.
Эдгээр асуудлыг шийдэхийн тулд бид янз бүрийн эсийн төрлүүдийг (CD4 + ба CD8 + Т эсүүдийг оруулаад), мөн хавдрын дотор болон хооронд судлахын тулд мэдрэмтгий эсийн тусгаарлалт ба шингэн хроматографийн тандем масс спектрометр (LC-MS/MS) аргыг боловсруулсан. Түүний метаболитууд нь өвчтөний ижил асцит ба хавдрын орчин дахь эсүүдийг хамардаг. Бид энэ аргыг өндөр хэмжээст урсгалын цитометр болон нэг эсийн РНХ-ийн дараалал (scRNA-seq)-тэй хамт эдгээр гол популяцийн бодисын солилцооны төлөв байдлын өндөр нарийвчлалтай хөрөг зургийг гаргахын тулд ашигладаг. Энэ арга нь хавдрын Т эсүүдэд 1-метилникотинамид (MNA)-ийн түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэнийг илрүүлсэн бөгөөд in vitro туршилтаар MNA-ийн Т эсийн үйл ажиллагаанд дархлаа зохицуулах нөлөө өмнө нь мэдэгдээгүй болохыг харуулсан. Ерөнхийдөө энэ арга нь хавдар ба дархлааны эсүүдийн хоорондох харилцан бодисын солилцооны харилцан үйлчлэлийг илчилж, дархлааны зохицуулалтын метаболитуудын талаар өвөрмөц ойлголтыг өгдөг бөгөөд энэ нь Т эсэд суурилсан өндгөвчний хорт хавдрын дархлаа эмчилгээний эмчилгээний боломжуудыг эмчлэхэд хэрэгтэй байж болох юм.
Бид глюкозын шингээлтийг нэгэн зэрэг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлохын тулд өндөр хэмжээст урсгалын цитометрийг ашигласан [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоз (2-NBDG) болон митохондрийн идэвхжил [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) нь дархлааны эсүүд болон хавдрын эсийн популяцийг ялгадаг ердийн тэмдэглэгээнүүд юм (Хүснэгт S2 ба Зураг S1A). Энэхүү шинжилгээгээр Т эсүүдтэй харьцуулахад асцит болон хавдрын эсүүд глюкозын шингээлтийн түвшин өндөр боловч митохондрийн идэвхжилд бага ялгаа байгааг харуулсан. Хавдрын эсүүдийн [CD45-EpCAM (EpCAM)+] глюкозын дундаж шингээлт нь Т эсүүдийнхээс гурваас дөрөв дахин, CD4 + Т эсүүдийн глюкозын дундаж шингээлт нь CD8 + Т эсүүдийнхээс 1.2 дахин их байгаа нь хавдрын нэвчсэн лимфоцитууд (TIL) нь ижил TME-д ч гэсэн бодисын солилцооны өөр өөр шаардлага тавьдаг болохыг харуулж байна (Зураг 1A). Үүний эсрэгээр, хавдрын эсүүдийн митохондрийн идэвхжил нь CD4 + Т эсүүдийнхтэй төстэй бөгөөд хоёр төрлийн эсийн митохондрийн идэвхжил нь CD8 + Т эсүүдээс өндөр байдаг (Зураг 1B). Ерөнхийдөө эдгээр үр дүнгүүд нь бодисын солилцооны түвшинг харуулж байна. Хавдрын эсүүдийн бодисын солилцооны идэвхжил нь CD4 + Т эсүүдээс өндөр бөгөөд CD4 + Т эсүүдийн бодисын солилцооны идэвхжил нь CD8 + Т эсүүдээс өндөр байдаг. Эсийн төрлүүдийн хооронд эдгээр нөлөөллөөс үл хамааран CD4 + ба CD8 + Т эсүүдийн бодисын солилцооны төлөв байдал эсвэл тэдгээрийн асцит дахь харьцангуй харьцаанд хавдартай харьцуулахад тогтвортой ялгаа байхгүй (Зураг 1C). Үүний эсрэгээр CD45 эсийн фракцад хавдрын EpCAM+ эсүүдийн эзлэх хувь асциттай харьцуулахад нэмэгдсэн (Зураг 1D). Мөн бид EpCAM+ ба EpCAM-эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн хооронд бодисын солилцооны тодорхой ялгааг ажигласан. EpCAM+ (хавдрын) эсүүд нь EpCAM-эсүүдээс илүү глюкозын шингээлт болон митохондрийн идэвхжилтэй байдаг бөгөөд энэ нь TME-д хавдрын эсүүдийн фибробластуудын бодисын солилцооны идэвхжилээс хамаагүй өндөр байдаг (Зураг 1, E ба F).
(A ба B) Глюкозын шингээлтийн дундаж флуоресценцийн эрчим (MFI) (2-NBDG) (A) ба CD4 + Т эсүүдийн митохондрийн идэвхжил (MitoTracker бараан улаан) (B) Төлөөлөх график (зүүн) ба хүснэгтэд үзүүлсэн өгөгдөл (Баруун), асцит ба хавдрын CD8 + Т эсүүд ба EpCAM + CD45-хавдрын эсүүд. (C) Асцит ба хавдрын CD4 + ба CD8 + эсүүдийн (CD3 + Т эсүүдийн) харьцаа. (D) Асцит ба хавдрын (CD45−) EpCAM + хавдрын эсүүдийн эзлэх хувь. (E ба F) EpCAM + CD45-хавдар ба EpCAM-CD45-матрицын глюкозын шингээлт (2-NBDG) (E) ба митохондрийн идэвхжил (MitoTracker бараан улаан) (F) Төлөөлөх график (зүүн) ба хүснэгтэд үзүүлсэн өгөгдөл (Баруун) Асцит ба хавдрын эсүүд. (G) Урсгалын цитометрээр CD25, CD137 ба PD1-ийн илэрхийлэлийн төлөөлөх график. (H ба I) CD4 + Т эсүүд (H) болон CD8 + Т эсүүд (I) дээрх CD25, CD137 болон PD1 илэрхийлэл. (J ба K) CCR7 болон CD45RO-ийн илэрхийлэлд үндэслэсэн гэнэн, төвийн санах ой (Tcm), эффектор (Teff) болон эффекторын санах ой (Tem) фенотипүүд. Асцит ба хавдрын үед CD4 + Т эсүүд (J) болон CD8 + Т эсүүдийн (K) төлөөлөх зургууд (зүүн) болон хүснэгтэн өгөгдөл (баруун). P утгыг хосолсон t-тестээр тодорхойлно (*P<0.05, **P<0.01 ба ***P<0.001). Шугам нь таарсан өвчтөнүүдийг илэрхийлнэ (n = 6). FMO, флуоресценцийн хасах нэг; MFI, флуоресценцийн дундаж эрчим.
Цаашдын шинжилгээгээр өндөр нарийвчлалтай Т эсийн фенотипийн төлөвийн хооронд бусад мэдэгдэхүйц ялгааг илрүүлсэн. Хавдрын идэвхжсэн (Зураг 1, G-ээс I хүртэл) ба эффекторын санах ой (Зураг 1, J ба K) нь асцитаас (CD3 + Т эсийн эзлэх хувь) хамаагүй илүү түгээмэл байдаг. Үүнтэй адилаар, идэвхжүүлэлтийн маркерууд (CD25 ба CD137) ба хомсдолын маркеруудын илэрхийлэлээр фенотипийг шинжлэхэд [програмчлагдсан эсийн үхлийн уураг 1 (PD1)] эдгээр популяцийн бодисын солилцооны шинж чанарууд өөр боловч (Зураг S1, B-ээс E хүртэл), гэхдээ гэнэн, эффектор эсвэл санах ойн дэд бүлгүүдийн хооронд бодисын солилцооны мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдаагүй болохыг харуулсан (Зураг S1, F-ээс I хүртэл). Эдгээр үр дүнг эсийн фенотипийг автоматаар оноохын тулд машин сургалтын аргыг ашиглан баталгаажуулсан (21) бөгөөд энэ нь өвчтөний асцитад олон тооны ясны чөмөгний эсүүд (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) байгааг цаашид илрүүлсэн (Зураг S2A). Илэрсэн бүх эсийн төрлүүдийн дотроос энэхүү миелоид эсийн популяци нь глюкозын шингээлт болон митохондрийн идэвхжил хамгийн өндөр байгааг харуулсан (Зураг S2, B-ээс G хүртэл). Эдгээр үр дүнгүүд нь HGSC өвчтөнүүдийн асцит болон хавдрын үед илэрсэн олон эсийн төрлүүдийн хоорондох бодисын солилцооны хүчтэй ялгааг харуулж байна.
TIL-ийн метабономик шинж чанарыг ойлгоход тулгарч буй гол бэрхшээл бол хавдраас хангалттай цэвэршилт, чанар, тоо хэмжээний Т эсийн дээжийг ялгах хэрэгцээ юм. Сүүлийн үеийн судалгаагаар урсгалын цитометр дээр суурилсан ялгах, бөмбөлгөөр баяжуулах аргууд нь эсийн метаболитын профайлын өөрчлөлтөд хүргэж болзошгүйг харуулсан (22-24). Энэ асуудлыг даван туулахын тулд бид LC-MS/MS-ээр шинжилгээ хийхээс өмнө мэс заслын аргаар тайрсан хүний ​​өндгөвчний хорт хавдраас TIL-ийг ялгаж, тусгаарлахын тулд бөмбөлгөөр баяжуулах аргыг оновчтой болгосон (Материал ба аргуудыг үзнэ үү; Зураг 2A). Энэхүү протоколын метаболитын өөрчлөлтөд үзүүлэх ерөнхий нөлөөллийг үнэлэхийн тулд бид дээрх бөмбөлгөөр тусгаарлах алхамын дараа эрүүл доноруудын идэвхжүүлсэн Т эсийн метаболитын профайлыг бөмбөлгөөр тусгаарлагдаагүй боловч мөсөн дээр үлдсэн эсүүдтэй харьцуулсан. Энэхүү чанарын хяналтын шинжилгээгээр эдгээр хоёр нөхцөл байдлын хооронд өндөр хамаарал байгааг (r = 0.77), 86 метаболитын бүлгийн техникийн давтагдах чадвар нь өндөр давтагдах чадвартай болохыг тогтоожээ (Зураг 2B). Тиймээс эдгээр аргууд нь эсийн төрлийг баяжуулж буй эсүүдэд метаболитын шинжилгээг нарийвчлалтай хийж чаддаг бөгөөд ингэснээр HGSC-д тодорхой метаболитуудыг тодорхойлох анхны өндөр нарийвчлалтай платформыг бий болгож, улмаар хүмүүст эсийн өвөрмөц байдлын талаар илүү гүнзгий ойлголттой болох боломжийг олгодог. Бэлгийн солилцооны хөтөлбөр.
(A) Соронзон бөмбөлгөөр баяжуулах бүдүүвч диаграмм. LC-MS/MS-ээр шинжилгээ хийхээс өмнө эсүүд нь дараалсан гурван удаагийн соронзон бөмбөлгөөр баяжуулах эсвэл мөсөн дээр үлдэх болно. (B) Баяжуулах төрлийн метаболитуудын элбэгшилд үзүүлэх нөлөө. Баяжуулах төрөл бүрийн гурван хэмжилтийн дундаж ± SE. Саарал шугам нь 1:1 харьцааг илэрхийлнэ. Тэнхлэгийн шошгон дээр харуулсан давтагдсан хэмжилтийн анги доторх корреляци (ICC). NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Өвчтөний метаболит шинжилгээний ажлын урсгалын бүдүүвч диаграмм. Асцит эсвэл хавдрыг өвчтөнүүдээс цуглуулж, крио хадгална. Дээж бүрийн багахан хэсгийг урсгалын цитометрээр шинжилсэн бол үлдсэн дээжийг CD4+, CD8+ болон CD45- эсүүдэд гурван удаагийн баяжуулалт хийсэн. Эдгээр эсийн фракцуудыг LC-MS/MS ашиглан шинжилсэн. (D) Стандартчилагдсан метаболитуудын элбэгшлийн дулааны зураг. Дендрограмм нь дээжүүдийн хоорондох Евклидийн зайн Уордын кластерыг илэрхийлнэ. (E) Дээжийн метаболит газрын зургийн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA), дээж тус бүрийн гурван давталтыг харуулсан бөгөөд нэг өвчтөний дээжийг шугамаар холбосон. (F) Өвчтөнд тохирсон дээжийн метаболит профайлын PCA (өөрөөр хэлбэл хэсэгчилсэн нөөцийг ашиглах); дээжийн төрөл нь гүдгэр бүрхүүлээр хязгаарлагддаг. PC1, үндсэн бүрэлдэхүүн хэсэг 1; PC2, үндсэн бүрэлдэхүүн хэсэг 2.
Дараа нь бид энэхүү баяжуулах аргыг ашиглан зургаан HGSC өвчтөний анхдагч асцит ба хавдрын CD4+, CD8+ болон CD45 эсийн фракц дахь 99 метаболитыг шинжилсэн (Зураг 2C, Зураг S3A, Хүснэгт S3 ба S4). Сонирхож буй популяци нь анхны том амьд эсийн дээжийн 2%-70%-ийг эзэлдэг бөгөөд эсийн эзлэх хувь нь өвчтөнүүдийн хооронд маш их ялгаатай байдаг. Бөмбөлөгүүдийг салгасны дараа сонирхлын баяжуулсан фракц (CD4+, CD8+ эсвэл CD45-) нь дээжийн бүх амьд эсийн дунджаар 85%-иас илүү хувийг эзэлдэг. Энэхүү баяжуулах арга нь бидэнд хүний ​​хавдрын эдийн солилцооноос эсийн популяцийг шинжлэх боломжийг олгодог бөгөөд үүнийг том дээжээс хийх боломжгүй юм. Энэхүү протоколыг ашиглан бид l-кинуренин ба аденозин болох эдгээр хоёр сайн шинж чанартай дархлаа дарангуйлах метаболит нь хавдрын Т эсүүд эсвэл хавдрын эсүүдэд ихэссэн болохыг тогтоосон (Зураг S3, B ба C). Тиймээс эдгээр үр дүнгүүд нь өвчтөний эд эсээс биологийн хувьд чухал метаболитуудыг олох бидний эсийн ялгах болон массын спектрометрийн технологийн үнэн зөв, чадварыг харуулж байна.
Бидний шинжилгээгээр өвчтөнүүдийн дотор болон хоорондын эсийн төрлүүдийн бодисын солилцооны хүчтэй ялгаа илэрсэн (Зураг 2D ба Зураг S4A). Ялангуяа бусад өвчтөнүүдтэй харьцуулахад 70-р өвчтөнд бодисын солилцооны өөр шинж чанар илэрсэн (Зураг 2E ба Зураг S4B) нь өвчтөнүүдийн хооронд бодисын солилцооны мэдэгдэхүйц олон янз байдал байж болохыг харуулж байна. Бусад өвчтөнүүдтэй харьцуулахад (1.2-2 литр; Хүснэгт S1) 70-р өвчтөнд цуглуулсан асцитын нийт хэмжээ (80 мл) бага байсан гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний үеэр өвчтөнүүдийн хоорондын олон янз байдлын хяналт (жишээлбэл, хэсэгчилсэн илүүдлийн шинжилгээг ашиглан) нь эсийн төрлүүдийн хооронд тогтвортой өөрчлөлтийг харуулж байгаа бөгөөд эсийн төрөл ба/эсвэл бичил орчин нь метаболитын профайлын дагуу тодорхой нэгтгэгдсэн байдаг (Зураг 2F). Ганц метаболитын шинжилгээгээр эдгээр нөлөөг онцолж, эсийн төрөл ба бичил орчны хооронд мэдэгдэхүйц ялгааг илрүүлсэн. Хамгийн туйлын ялгаа нь ихэвчлэн CD45 эсүүд болон хавдрын дотор нэвчдэг CD4+ ба CD8+ эсүүдээр баяждаг MNA гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй (Зураг 3A). CD4 + эсийн хувьд энэ нөлөө хамгийн тод илэрдэг бөгөөд CD8 + эсийн MNA нь хүрээлэн буй орчноос хүчтэй нөлөөлдөг бололтой. Гэсэн хэдий ч энэ нь чухал биш, учир нь зургаан өвчтөний зөвхөн гурвыг нь хавдрын CD8 + оноогоор үнэлэх боломжтой. MNA-аас гадна асцит болон хавдрын янз бүрийн төрлийн эсүүдэд TIL-д муу тодорхойлогддог бусад метаболитууд нь мөн ялгаатай баялаг байдаг (Зураг S3 ба S4). Тиймээс эдгээр өгөгдөл нь цаашдын судалгаанд шаардлагатай дархлаа зохицуулах метаболитуудын ирээдүйтэй багцыг харуулж байна.
(A) Асцит болон хавдрын CD4+, CD8+ болон CD45- эсүүдэд MNA-ийн хэвийн агууламж. Хайрцагны график нь медиан (шугам), квартил хоорондын хүрээ (хүрээний нугас) болон өгөгдлийн хүрээг квартил хоорондын хүрээнээс (хүрээний сахал) 1.5 дахин их хэмжээгээр харуулна. Өвчтөний материал ба арга зүйд тайлбарласны дагуу өвчтөний лимма утгыг ашиглан P утгыг тодорхойлно уу (*P<0.05 ба **P<0.01). (B) MNA бодисын солилцооны бүдүүвч диаграмм (60). Метаболитууд: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоз; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ферментүүд (ногоон): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуин; NAMPT, никотинамид фосфорибосилтрансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибосид киназа; NMNAT, никотинамид моно нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) Асцит (саарал) ба хавдрын scRNA-sequence-ийн t-SNE (улаан; n = 3 өвчтөн). (D) scRNA-sequence ашиглан тодорхойлсон өөр өөр эсийн популяци дахь NNMT-ийн илэрхийлэл. (E) SK-OV-3, хүний ​​үр хөврөлийн бөөр (HEK) 293T, Т эсүүд болон MNA-аар эмчилсэн Т эсүүдэд NNMT болон AOX1-ийн илэрхийлэл. Эвхэгдсэн илэрхийлэлийг SK-OV-3-тай харьцуулан харуулав. SEM-тэй илэрхийллийн хэв маягийг харуулав (n = 6 эрүүл донор). 35-аас дээш Ct утгыг илрүүлэх боломжгүй гэж үзнэ (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, Т эсүүд болон 8мМ MNA-аар эмчилсэн Т эсүүдэд SLC22A1 болон SLC22A2-ийн илэрхийлэл. Эвхэгдсэн илэрхийлэлийг SK-OV-3-тай харьцуулан харуулав. SEM-тэй илэрхийллийн хэв маягийг харуулав (n = 6 эрүүл донор). 35-аас дээш Ct утгыг илрүүлэх боломжгүй гэж үзнэ (UD). (G) MNA-тай 72 цагийн турш инкубацийн дараа идэвхжүүлсэн эрүүл донорын Т эсүүдэд эсийн MNA агууламж. SEM-тэй илэрхийллийн хэв маягийг харуулав (n = 4 эрүүл донор).
MNA нь S-аденозил-1-метионин (SAM)-аас метил бүлгийг никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; Зураг 3B)-ээр никотинамид (NA) руу шилжүүлэх замаар үүсдэг. NNMT нь хүний ​​янз бүрийн хорт хавдарт хэт ихээр илэрхийлэгддэг бөгөөд тархалт, инвазив болон үсэрхийлэлтэй холбоотой байдаг (25-27). TME-ийн Т эсүүд дэх MNA-ийн эх үүсвэрийг илүү сайн ойлгохын тулд бид гурван HGSC өвчтөний асцит ба хавдрын эсийн төрлүүдийн хооронд NNMT-ийн илэрхийлэлийг тодорхойлохын тулд scRNA-seq ашигласан (Хүснэгт S5). Ойролцоогоор 6500 эсийн шинжилгээгээр асцит ба хавдрын орчинд NNMT-ийн илэрхийлэл нь фибробласт ба хавдрын эсийн популяцид хязгаарлагдсан болохыг харуулсан (Зураг 3, C ба D). PTPRC (CD45 +)-ийг илэрхийлдэг популяцид NNMT-ийн илэрхий илэрхийлэл байхгүй байгааг тэмдэглэх нь зүйтэй (Зураг 3D ба Зураг S5A), энэ нь метаболит спектрт илэрсэн MNA нь Т эсүүдэд нэвтэрсэн болохыг харуулж байна. Альдегид оксидаза 1 (AOX1)-ийн экспресс нь MNA-г 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) эсвэл 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR) болгон хувиргадаг; Зураг 3B) нь COL1A1 илэрхийлдэг фибробластуудын популяциар хязгаарлагддаг (Зураг S5A) бөгөөд энэ нь хамтдаа Т эсүүд нь уламжлалт MNA солилцооны чадваргүй болохыг харуулж байна. Эдгээр MNA-тай холбоотой генүүдийн экспрессийн хэв маягийг HGSC өвчтөнүүдийн асцитаас авсан хоёр дахь бие даасан эсийн өгөгдлийн багцыг ашиглан баталгаажуулсан (Зураг S5B; n = 6) (16). Үүнээс гадна, MNA-аар эмчилсэн эрүүл донорын Т эсүүдийн тоон полимеразын гинжин урвалын (qPCR) шинжилгээгээр хяналтын SK-OV-3 өндгөвчний хавдрын эсүүдтэй харьцуулахад NNMT эсвэл AOX1 бараг илэрхийлэгдээгүй болохыг харуулсан (Зураг 3E). Эдгээр гэнэтийн үр дүнгүүд нь MNA нь фибробласт эсвэл хавдраас TME-ийн зэргэлдээ Т эсүүд рүү ялгарч болохыг харуулж байна.
Хэдийгээр нэр дэвшигчдэд уусдаг тээвэрлэгч 22 (SLC22) бүл (SLC22A1, SLC22A2 болон SLC22A3)-ээр кодлогдсон органик катион тээвэрлэгчдийн 1-3 бүл (OCT1, OCT2 болон OCT3) багтдаг боловч MNA-ийн боломжит тээвэрлэгчид тодорхойгүй хэвээр байна (28). Эрүүл донорын Т эсүүдийн mRNA-ийн QPCR нь SLC22A1-ийн экспрессийн түвшин бага боловч SLC22A2-ийн түвшинг илрүүлээгүй бөгөөд энэ нь өмнө нь уран зохиолд мэдээлэгдсэн болохыг баталсан (Зураг 3F) (29). Үүний эсрэгээр SK-OV-3 өндгөвчний хавдрын эсийн шугам нь хоёр тээвэрлэгчийн өндөр түвшинг илэрхийлсэн (Зураг 3F).
Т эсүүд гадны MNA-г шингээх чадвартай эсэхийг шалгахын тулд эрүүл донорын Т эсүүдийг MNA-ийн өөр өөр концентрацитай орчинд 72 цагийн турш өсгөвөрлөсөн. Гадны MNA байхгүй үед MNA-ийн эсийн агууламжийг илрүүлэх боломжгүй (Зураг 3G). Гэсэн хэдий ч гадны MNA-аар эмчилсэн идэвхжүүлсэн Т эсүүд эсүүдэд MNA-ийн агууламж тунгаас хамааралтайгаар 6 мМ MNA хүртэл нэмэгдсэн (Зураг 3G). Энэ үр дүн нь тээвэрлэгчийн илэрхийлэл бага, эсийн доторх MNA метаболизмыг хариуцдаг гол фермент байхгүй ч TIL нь MNA-г шингээж авах боломжтой гэдгийг харуулж байна.
Өвчтөний Т эсүүд дэх метаболитын спектр болон in vitro MNA шингээлтийн туршилтууд нь хорт хавдартай холбоотой фибробластууд (CAF) MNA ялгаруулдаг бөгөөд хавдрын эсүүд TIL-ийн фенотип болон үйл ажиллагааг зохицуулж болзошгүй гэсэн магадлалыг нэмэгдүүлдэг. MNA-ийн Т эсүүдэд үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохын тулд эрүүл донорын Т эсүүдийг in vitro нөхцөлд MNA байгаа эсэхээс үл хамааран идэвхжүүлж, тэдгээрийн тархалт болон цитокины үйлдвэрлэлийг үнэлсэн. MNA-г хамгийн өндөр тунгаар нэмснээс хойш 7 хоногийн дараа популяцийн хоёр дахин нэмэгдэх тоо дунд зэрэг буурсан бол бүх тунгаар эрч хүч хадгалагдсан (Зураг 4A). Үүнээс гадна, гадны MNA-г эмчлэх нь хавдрын үхжилийн хүчин зүйл-α илэрхийлдэг CD4+ ба CD8+ Т эсүүдийн эзлэх хувийг нэмэгдүүлэхэд хүргэсэн (TNFα; Зураг 4B). Үүний эсрэгээр, IFN-γ-ийн эсийн доторх үйлдвэрлэл CD4+ Т эсүүдэд мэдэгдэхүйц буурсан боловч CD8+ Т эсүүдэд буураагүй бөгөөд интерлейкин 2-т мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гараагүй (IL-2; Зураг 4, C ба D). Тиймээс эдгээр MNA-аар эмчилсэн Т эсийн өсгөврөөс гаргаж авсан дээд давхаргын фермент холбоот иммуносорбент шинжилгээ (ELISA) нь TNFα-ийн мэдэгдэхүйц өсөлт, IFN-γ-ийн бууралт, IL-2-ийн өөрчлөлт гараагүй болохыг харуулсан (Зураг 4, E-ээс G хүртэл). . IFN-γ-ийн бууралт нь MNA нь Т эсийн хавдрын эсрэг үйл ажиллагааг дарангуйлахад чухал үүрэг гүйцэтгэж болохыг харуулж байна. MNA-ийн Т эсийн зуучлалтай цитотоксик чанарт үзүүлэх нөлөөг дуурайлган хийхийн тулд ногоон флуоресцент уураг (GFP) -CAR-T) эсүүдээр зохицуулагддаг фолийн рецептор α болон CAR-T (GFP)-ийг чиглүүлдэг химер антиген рецептор T (FRα-CAR-T) эсүүдийг эрүүл донорын захын цусны мононуклеар эсүүд (PBMC) үүсгэдэг. CAR-T эсүүдийг MNA-ийн дэргэд 24 цагийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь фолийн рецептор α-г илэрхийлдэг хүний ​​SK-OV-3 өндгөвчний хавдрын эсүүдтэй 10:1 эффектор ба зорилтот харьцаатайгаар хамт өсгөвөрлөв. MNA эмчилгээ нь FRα-CAR-T эсүүдийн устгах идэвхжил мэдэгдэхүйц буурахад хүргэсэн бөгөөд энэ нь аденозиноор эмчилсэн FRα-CAR-T эсүүдтэй төстэй байв (Зураг 4H).
(A) 7 дахь өдөр өсгөвөрөөс шууд гарсан амьдрах чадвартай эсийн нийт тоо болон популяцийн хоёр дахин ихсэлт (PD). Баган график нь зургаан эрүүл донорын дундаж + SEM-ийг илэрхийлнэ. Дор хаяж n = 3 бие даасан туршилтын өгөгдлийг илэрхийлнэ. (B-ээс D хүртэл) CD3/CD28 болон IL-2-ийг Т эсүүдийг тус тусын MNA концентрацид 7 хоногийн турш идэвхжүүлэхэд ашигласан. Шинжилгээ хийхийн өмнө эсүүдийг GolgiStop-той PMA/иономициноор 4 цагийн турш өдөөсөн. Т эсүүд дэх TNFα (B)-ийн илэрхийлэл. Амьд эсүүд дэх TNFα-ийн илэрхийлэлийн жишээ зураг (зүүн) болон хүснэгтэн өгөгдөл (баруун). Т эсүүд дэх IFN-γ (C) болон IL-2 (D)-ийн илэрхийлэл. Цитокины илэрхийлэлийг урсгалын цитометрээр хэмжсэн. Баган график нь дундаж (n = 6 эрүүл донор) + SEM-ийг илэрхийлнэ. P утгыг тодорхойлохын тулд дисперсийн нэг талын шинжилгээ болон давтан хэмжилтийг (*P<0.05 ба **P<0.01) ашиглана уу. Дор хаяж n = 3 бие даасан туршилтын өгөгдлийг илэрхийлнэ. (E-ээс G хүртэл) CD3/CD28 болон IL-2-ийг Т эсүүдийг тус тусын MNA концентрацид 7 хоногийн турш идэвхжүүлэхэд ашигласан. PMA/иономицин өдөөлтөөс 4 цагийн өмнө болон дараа тэжээлт орчныг цуглуулсан. TNFα (E), IFN-γ (F) болон IL-2 (G)-ийн концентрацийг ELISA-аар хэмжсэн. Баган график нь дундаж утгыг (n = 5 эрүүл донор) + SEM-ийг илэрхийлнэ. P утгыг дисперсийн нэг талын шинжилгээ болон давтан хэмжилтийг ашиглан тодорхойлсон (*P<0.05). Цэгтэй шугам нь илрүүлэлтийн илрүүлэлтийн хязгаарыг заана. (H) Эсийн задралын шинжилгээ. FRα-CAR-T эсвэл GFP-CAR-T эсүүдийг 24 цагийн турш аденозин (250μM) эсвэл MNA (10 mM)-ээр тохируулсан, эсвэл эмчлээгүй (Ctrl) үлдээсэн. SK-OV-3 эсийн үхлийн хувийг хэмжсэн. P утгыг Welch t тестээр тодорхойлсон (*P<0.5 ба **P<0.01).
MNA-аас хамааралтай TNFα экспрессийн зохицуулалтын механизмыг ойлгохын тулд MNA-аар эмчилсэн Т эсүүдийн TNFα mRNA-ийн өөрчлөлтийг үнэлсэн (Зураг 5A). MNA-аар эмчилсэн эрүүл донорын Т эсүүд TNFα транскрипцийн түвшин хоёр дахин нэмэгдсэн нь MNA нь TNFα транскрипцийн зохицуулалтаас хамааралтай болохыг харуулж байна. Энэхүү боломжит зохицуулалтын механизмыг судлахын тулд TNFα-г зохицуулдаг хоёр мэдэгдэж буй транскрипцийн хүчин зүйл болох идэвхжүүлсэн Т эсийн цөмийн хүчин зүйл (NFAT) ба тодорхой уураг 1 (Sp1)-ийг TNFα проксимал промотортой MNA холболтын хариуд үнэлсэн (30). TNFα промотор нь нэг газарт давхцаж буй 6 тодорхойлогдсон NFAT холболтын цэг болон 2 Sp1 холболтын цэгийг агуулдаг [-5'cap-аас -55 суурь хос (bp)] (30). Хроматины иммунопресипитаци (ChIP) нь MNA-аар эмчилсэн үед Sp1-ийн TNFα промотортой холболт гурван дахин нэмэгдсэн болохыг харуулсан. NFAT-ийн нэгдэл мөн нэмэгдэж, ач холбогдолд ойртсон (Зураг 5B). Эдгээр өгөгдөл нь MNA нь Sp1 транскрипцээр дамжуулан TNFα-ийн илэрхийлэлийг, мөн бага хэмжээгээр NFAT-ийн илэрхийлэлийг зохицуулдаг болохыг харуулж байна.
(A) MNA-гүйгээр өсгөвөрлөсөн Т эсүүдтэй харьцуулахад MNA-аар эмчилсэн Т эсүүдэд TNFα экспрессийн атираат өөрчлөлтийг харуулав. SEM-тэй экспрессийн хэв маягийг харуулав (n = 5 эрүүл донор). Дор хаяж n = 3 бие даасан туршилтын өгөгдлийг илэрхийлнэ. (B) NFAT болон Sp1-ийг 4 цагийн турш (Ctrl) болон PMA/иономицин өдөөлттэй хослуулсны дараа 8 мМ MNA-аар эмчилсэн эсвэл эмчилээгүй Т эсүүдийн TNFα промоторыг харуулав. Иммуноглобулин G (IgG) болон H3-ийг дархлаа тунадасжуулалтын сөрөг болон эерэг хяналтын бүлэг болгон тус тус ашигласан. ChIP-ийн тоон үзүүлэлтээр MNA-аар эмчилсэн эсүүдэд Sp1 болон NFAT-ийн TNFα промотортой холбогдох нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хэд дахин нэмэгдсэн болохыг харуулсан. Дор хаяж n = 3 бие даасан туршилтын өгөгдлийг илэрхийлнэ. Олон t-тестээр тодорхойлогдсон P утга (*** P <0.01). (C) HGSC-ийн асциттай харьцуулахад Т эсүүд (цитотоксик бус) хавдрын TNF экспрессийг нэмэгдүүлсэн. Өнгө нь өөр өөр өвчтөнүүдийг илэрхийлнэ. Харуулсан эсүүдийг санамсаргүй байдлаар 300 хүртэл түүвэрлэж, хэт их суналтыг хязгаарлахын тулд чичиргээнд оруулсан (** Padj = 0.0076). (D) Өндгөвчний хорт хавдрын MNA-ийн санал болгож буй загвар. MNA нь хавдрын эсүүд болон TME дахь фибробластуудад үүсдэг бөгөөд Т эсүүдэд шингэдэг. MNA нь Sp1-ийн TNFα промотортой холбогдохыг нэмэгдүүлж, TNFα транскрипц болон TNFα цитокины үйлдвэрлэлийг нэмэгдүүлдэг. MNA нь мөн IFN-γ-ийн бууралтад хүргэдэг. Т эсийн үйл ажиллагааг дарангуйлах нь устгах чадварыг бууруулж, хавдрын өсөлтийг хурдасгадаг.
Тайлангаас харахад TNFα нь урд болон хойд хэсгээс хамааралтай хавдрын эсрэг болон хавдрын эсрэг үйлчилгээтэй боловч өндгөвчний хорт хавдрын өсөлт, үсэрхийллийг дэмжихэд сайн мэддэг үүрэг гүйцэтгэдэг (31-33). Тайлангаас харахад өндгөвчний хорт хавдартай өвчтөнүүдийн асцит болон хавдрын эдэд TNFα-ийн агууламж хоргүй эдээс өндөр байдаг (34-36). Механизмын хувьд TNFα нь цагаан цусны эсийн идэвхжил, үйл ажиллагаа, тархалтыг зохицуулж, хорт хавдрын эсийн фенотипийг өөрчилж чаддаг (37, 38). Эдгээр олдворуудтай нийцүүлэн дифференциал генийн экспрессийн шинжилгээгээр TNF нь асциттай харьцуулахад хавдрын эдэд байгаа Т эсүүдэд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг харуулсан (Зураг 5C). TNF экспрессийн өсөлт нь зөвхөн цитотоксик бус фенотиптэй Т эсийн популяцид илэрсэн (Зураг S5A). Товчхондоо, эдгээр өгөгдөл нь MNA нь HGSC-д дархлаа дарангуйлах болон хавдрыг дэмжих давхар нөлөөтэй гэсэн үзэл бодлыг дэмжиж байна.
Урсгалын цитометр дээр суурилсан флуоресцент шошгололт нь TIL бодисын солилцоог судлах гол арга болсон. Эдгээр судалгаагаар захын цусны лимфоцитууд эсвэл хоёрдогч лимфоид эрхтний Т эсүүдтэй харьцуулахад хулгана болон хүний ​​TIL нь глюкозыг шингээх хандлага өндөр (4, 39) ба митохондрийн үйл ажиллагаа аажмаар алдагддаг (19, 40) болохыг харуулсан. Энэхүү судалгаанд бид ижил төстэй үр дүнг ажигласан боловч гол хөгжил нь хавдрын эсийн бодисын солилцоо болон ижил тайрсан хавдрын эдээс TIL-ийг харьцуулах явдал юм. Өмнөх зарим тайлантай нийцүүлэн асцит болон хавдрын хавдрын (CD45-EpCAM +) эсүүд CD8 + ба CD4 + Т эсүүдээс илүү их глюкозын шингээлттэй байдаг нь хавдрын эсийн глюкозын өндөр шингээлтийг Т эсүүдтэй харьцуулж болохыг дэмжиж байна. Т эсийн өрсөлдөөний тухай ойлголт. TME. Гэсэн хэдий ч хавдрын эсийн митохондрийн идэвхжил нь CD8 + Т эсүүдээс өндөр боловч митохондрийн идэвхжил нь CD4 + Т эсүүдтэй төстэй юм. Эдгээр үр дүнгүүд нь исэлдэлтийн солилцоо нь хавдрын эсүүдэд чухал гэсэн шинээр гарч ирж буй сэдвийг бататгаж байна (41, 42). Тэд мөн CD8 + Т эсүүд нь CD4 + Т эсүүдээс илүү исэлдэлтийн үйл ажиллагааны алдагдалд илүү өртөмтгий байж болох эсвэл CD4 + Т эсүүд митохондрийн идэвхжилийг хадгалахын тулд глюкозоос бусад нүүрстөрөгчийн эх үүсвэрийг ашиглаж болно гэж үзэж байна (43, 44). Асцит дахь CD4 + Т эффектор, Т эффекторын санах ой болон Т төвийн санах ойн эсүүдийн хооронд глюкозын шингээлт эсвэл митохондрийн идэвхжилд ямар ч ялгаа ажиглагдаагүй гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Үүнтэй адил хавдрын CD8 + Т эсийн ялгарах төлөв нь глюкозын шингээлтийн өөрчлөлттэй ямар ч холбоогүй бөгөөд in vitro өсгөвөрлөсөн Т эсүүд болон in vivo хүний ​​TIL-ийн хоорондох мэдэгдэхүйц ялгааг онцолж байна (22). Эдгээр ажиглалтыг мөн эсийн популяцийн тэгш бус автомат хуваарилалтыг ашиглан баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь хавдрын эсүүдээс илүү глюкозын шингээлт болон митохондрийн идэвхжил өндөртэй CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + эсүүд зонхилох боловч бодисын солилцооны идэвхтэй эсийн популяцитай болохыг тогтоосон. Энэ популяци нь scRNA-seq шинжилгээнд тодорхойлогдсон миелоид дарангуйлагч эсүүд эсвэл плазмацитоид дендрит эсүүдийн таамаглаж буй дэд популяцийг төлөөлж болно. Хэдийгээр эдгээр хоёр тохиолдол хүний ​​өндгөвчний хавдрын үед бүртгэгдсэн боловч [45] эдгээр нь миелоид дэд популяцийг тайлбарлах шаардлагатай хэвээр байна. Цаашид энэхүү миелоид дэд популяцийг тодорхойлох шаардлагатай байна.
Урсгалын цитометр дээр суурилсан аргууд нь эсийн төрлүүдийн хоорондох глюкоз болон исэлдэлтийн солилцооны ерөнхий ялгааг тодруулж чаддаг ч TME-д митохондрийн солилцоонд глюкоз эсвэл бусад нүүрстөрөгчийн эх үүсвэрээс үүссэн нарийн метаболитуудыг хараахан тогтоогоогүй байна. Өгөгдсөн TIL дэд бүлэгт метаболит байгаа эсэх, байхгүй байгааг оноохын тулд эсийн популяцийг тайрсан эдээс цэвэрлэх шаардлагатай. Тиймээс бидний эсийн баяжуулах арга нь массын спектрометртэй хослуулан өвчтөний дээжинд Т эсүүд болон хавдрын эсийн популяцид ялгаатай баяжуулсан метаболитуудын талаар ойлголт өгөх боломжтой. Энэ арга нь флуоресценцийн идэвхжүүлсэн эсийн ялгалтаас давуу талтай боловч тодорхой метаболитын сангууд нь төрөлхийн тогтвортой байдал болон/эсвэл хурдан эргэлтийн хурдаас шалтгаалан нөлөөлж болзошгүй (22). Гэсэн хэдий ч бидний арга нь дээжийн төрлүүдийн хооронд маш их ялгаатай байдаг тул хоёр хүлээн зөвшөөрөгдсөн дархлаа дарангуйлагч метаболит болох аденозин ба кинуренинийг тодорхойлж чадсан.
Хавдар болон TIL дэд хэв шинжийн метабономик шинжилгээ нь өндгөвчний TME-д метаболитуудын үүргийн талаар илүү их ойлголт өгдөг. Нэгдүгээрт, урсгалын цитометрийг ашиглан бид хавдар болон CD4 + Т эсүүдийн хооронд митохондрийн идэвхжилд ялгаа байхгүй болохыг тогтоосон. Гэсэн хэдий ч LC-MS/MS шинжилгээгээр эдгээр популяцийн дунд метаболитын элбэгшилд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гарсан нь TIL метаболизм болон түүний нийт бодисын солилцооны идэвхжилийн талаарх дүгнэлтийг сайтар тайлбарлах шаардлагатай байгааг харуулж байна. Хоёрдугаарт, MNA нь асцитын CD45 эсүүд болон Т эсүүдийн хооронд хамгийн их ялгаатай метаболит бөгөөд хавдар биш юм. Тиймээс хуваарилалт болон хавдрын байршил нь TIL метаболизмд өөр өөр нөлөө үзүүлж болох бөгөөд энэ нь тухайн бичил орчинд байж болох олон янз байдлыг онцолж өгдөг. Гуравдугаарт, MNA үүсгэдэг NNMT ферментийн илэрхийлэл нь голчлон CAF-ээр хязгаарлагддаг бөгөөд энэ нь бага хэмжээгээр хавдрын эсүүд боловч хавдрын гаралтай Т эсүүдэд илрэх MNA түвшин ажиглагддаг. Өндгөвчний CAF-д NNMT-ийн хэт их илэрхийлэл нь хорт хавдар үүсгэх нөлөөтэй бөгөөд энэ нь CAF метаболизм, хавдрын инвази болон үсэрхийллийг өдөөдөгтэй холбоотой юм (27). Хэдийгээр TIL-ийн нийт түвшин дунд зэрэг боловч CAF дахь NNMT-ийн илэрхийлэл нь Хорт хавдрын геномын атлас (TCGA) мезенхимийн дэд төрөлтэй нягт холбоотой бөгөөд энэ нь тааруухан тавилантай холбоотой юм (27, 46, 47). Эцэст нь, MNA-ийн задралыг хариуцдаг AOX1 ферментийн илэрхийлэл нь CAF популяцид хязгаарлагдмал байдаг бөгөөд энэ нь Т эсүүд MNA-г задлах чадваргүй болохыг харуулж байна. Эдгээр үр дүнгүүд нь энэхүү олдворыг баталгаажуулахын тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байгаа ч Т эсүүд дэх MNA-ийн өндөр түвшин нь дархлаа дарангуйлах CAF бичил орчин байгааг илтгэж болно гэсэн санааг дэмжиж байна.
MNA тээвэрлэгчдийн экспрессийн түвшин бага, MNA бодисын солилцоонд оролцдог гол уургуудын түвшин илрэхгүй байгааг харгалзан үзвэл Т эсүүдэд MNA байгаа нь гэнэтийн зүйл юм. NNMT болон AOX1-ийн аль алиныг нь scRNA-seq шинжилгээ болон хоёр бие даасан когортын зорилтот qPCR шинжилгээгээр илрүүлж чадаагүй. Эдгээр үр дүнгээс харахад MNA нь Т эсүүдээр нийлэгждэггүй, харин эргэн тойрны TME-ээс шингэдэг болохыг харуулж байна. In vitro туршилтууд нь Т эсүүд гадны MNA хуримтлуулах хандлагатай байгааг харуулж байна.
Бидний in vitro судалгаагаар экзоген MNA нь Т эсүүдэд TNFα-ийн экспрессийг өдөөж, Sp1-ийг TNFα промотортой холбохыг нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан. TNFα нь хавдрын эсрэг болон хавдрын эсрэг аль алиныг нь агуулдаг боловч өндгөвчний хорт хавдрын үед TNFα нь өндгөвчний хорт хавдрын өсөлтийг дэмждэг (31-33). Өндгөвчний хавдрын эсийн өсгөвөрт TNFα-г саармагжуулах эсвэл хулганы загварт TNFα дохиог арилгах нь TNFα-аар дамждаг үрэвслийн цитокины үйлдвэрлэлийг сайжруулж, хавдрын өсөлтийг дарангуйлдаг (32, 35). Тиймээс энэ тохиолдолд TME-ээс гаралтай MNA нь аутокрин гогцоонд дамжин TNFα-аас хамааралтай механизмаар үрэвслийн эсрэг метаболит болж, улмаар өндгөвчний хорт хавдар үүсэх, тархахыг дэмждэг (31). Энэ боломжид үндэслэн TNFα блокадааг өндгөвчний хорт хавдрын эмчилгээний боломжит бодис болгон судалж байна (37, 48, 49). Үүнээс гадна, MNA нь CAR-T эсийн өндгөвчний хавдрын эсүүдэд үзүүлэх цитотоксик чанарыг бууруулдаг бөгөөд энэ нь MNA-аар дамждаг дархлаа дарангуйлах нэмэлт нотолгоог өгдөг. Эдгээр үр дүнгүүд нь хавдар болон CAF эсүүд MNA-г эсийн гаднах TME руу ялгаруулдаг загварыг харуулж байна. (i) TNF-ээр өдөөгдсөн өндгөвчний хорт хавдрын өсөлтийг өдөөх болон (ii) MNA-ээр өдөөгдсөн Т эсийн цитотоксик идэвхжилийг дарангуйлах замаар энэ нь хавдрын давхар нөлөө үзүүлж болзошгүй (Зураг 5D).
Эцэст нь хэлэхэд, энэхүү судалгаагаар эсийг хурдан баяжуулах, нэг эсийн дараалал тогтоох, бодисын солилцооны профайлыг хослуулан хэрэглэснээр HGSC өвчтөнүүдийн хавдар болон асцитын эсүүдийн хооронд асар их дархлаа солилцооны ялгаа байгааг илрүүлсэн. Энэхүү цогц шинжилгээгээр Т эсүүдийн хооронд глюкозын шингээлт болон митохондрийн идэвхжилд ялгаа байгааг харуулсан бөгөөд MNA нь эсийн бус бие даасан дархлааны зохицуулагч метаболит болохыг тогтоосон. Эдгээр өгөгдөл нь TME нь хүний ​​хорт хавдрын үед Т эсийн бодисын солилцоонд хэрхэн нөлөөлдөгт нөлөөлдөг. Т эсүүд болон хорт хавдрын эсүүдийн хоорондох шим тэжээлийн шууд өрсөлдөөнийг мэдээлсэн боловч метаболитууд нь хавдрын явцыг дэмжих, эндоген дархлааны хариу урвалыг дарангуйлах шууд бус зохицуулагч болж чаддаг. Эдгээр зохицуулагч метаболитуудын функциональ үүргийн талаарх дэлгэрэнгүй тайлбар нь хавдрын эсрэг дархлааны хариу урвалыг сайжруулах өөр стратегиудыг нээж өгч магадгүй юм.
Өвчтөний дээж болон эмнэлзүйн мэдээллийг Канадын Эдийн Сангийн Сүлжээгээр баталгаажсан Бритиш Колумбын Хорт Хавдрын Судалгааны Ёс Зүйн Хороо болон Британийн Колумбын Их Сургуулийн баталсан протоколын дагуу (H07-00463) бүх өвчтөний дээж болон эмнэлзүйн мэдээлэл нь бичгээр зөвшөөрөл авсан эсвэл албан ёсоор зөвшөөрөлөөсөө татгалзсан. Дээжийг баталгаажсан БиоБанк (BRC-00290)-д хадгалдаг. Өвчтөний дэлгэрэнгүй шинж чанарыг S1 ба S5 хүснэгтэд үзүүлэв. Хүйтэн хадгалахын тулд өвчтөний хавдрын дээжийг механик аргаар задалж, дараа нь 100 микрон шүүлтүүрээр түлхэж нэг эсийн суспензийг гаргаж авдаг. Өвчтөний асцитыг 4°C температурт 1500 эрг/мин хурдтайгаар 10 минутын турш центрифугээр ялгаж, эсийг нунтаглаж, дээд давхаргыг зайлуулдаг. Хавдар болон асцитаас гаргаж авсан эсүүдийг 50% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн хүний ​​AB ийлдэс (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) болон 10% диметил сульфоксидод крио хадгалсан. Эдгээр хадгалсан дан эсийн суспензийг гэсгээж, доор тайлбарласан метаболизм болон метаболит тодорхойлоход ашигласан.
Бүрэн тэжээлт орчин нь 0.22 мкм шүүсэн 50:50 нэмэлттэй RPMI 1640: AimV-ээс бүрдэнэ. RPMI 1640 + 2.05 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific)-ийг 10% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн хүний ​​AB ийлдэс (Sigma-Aldrich), 12.5 мМ Хепес (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 х Пенициллин Стрептомицин (PenStrep) уусмал (Thermo Fisher Scientific) болон 50 мкМ-меркаптоэтанолоор баяжуулсан. AimV (Invitrogen)-ийг 20 мМ Хепес (Thermo Fisher Scientific) болон 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific)-ээр баяжуулсан. Урсгалын цитометрийн будах буфер нь 3% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн AB хүний ​​ийлдэс (Sigma)-аар баяжуулсан 0.22 мкм шүүсэн фосфатын буфержуулсан давсны уусмал (PBS; Invitrogen)-ээс бүрдсэн. Эсийн баяжуулалтын буфер нь 0.22μm шүүгдсэн PBS-ээс бүрдэх бөгөөд 0.5% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн хүний ​​AB ийлдэс (Sigma-Aldrich)-аар баяжуулсан.
37°C бүрэн орчинд эсүүдийг 10 nM MT DR болон 100 μM 2-NBDG-ээр 30 минутын турш будсан. Дараа нь эсүүдийг амьдрах чадварын будагч eF506-аар 4°C-д 15 минутын турш будсан. Эсүүдийг FC Block (eBioscience) болон Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences)-д дахин уусгаж, урсгалын цитометрийн будгийн буферт шингэлж (үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу), өрөөний температурт 10 минут инкубацална. Эсүүдийг эсрэгбиеийн багцаар (Хүснэгт S2) урсгалын цитометрийн будгийн буферт 4°C-д 20 минутын турш будна. Шинжилгээний өмнө эсүүдийг урсгалын цитометрийн будгийн буферт (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R тохиргоо) дахин уусгана. Эсийн тооллогын өгөгдлийг шинжлэхийн тулд SpectroFlo болон FlowJo V10 ашиглан, өгөгдлийг үүсгэхийн тулд GraphPad Prism 8 ашиглана. 2-NBDG болон MT DR-ийн флуоресценцийн дундаж эрчим (MFI)-ийг лог-нормчилсон бөгөөд дараа нь хосолсон t тестийг статистик шинжилгээнд ашиглан таарсан өвчтөнүүдийг тооцсон. 40-өөс цөөн тохиолдолтой бүх популяцийг шинжилгээнээс хасаж, статистик шинжилгээ болон өгөгдлийг дүрслэхээс өмнө сөрөг утгуудын хувьд 1 MFI утгыг оруулна уу.
Дээрх процессын самбарын гараар хаалт хийх стратегийг нөхөхийн тулд бид FlowJo дахь үхсэн эсийг устгасны дараа эсийг популяцид автоматаар оноохын тулд хэлбэр хязгаарлалтын модны (FAUST) (21) бүрэн тайлбарыг ашигласан. Бид буруу хуваарилагдсан (PD1+-ийг PD1-хавдрын эсүүдтэй нэгтгэх) болон хадгалагдсан популяцийг нэгтгэхийн тулд гаралтыг гараар удирддаг. Түүвэр бүр дунджаар 2%-иас дээш эс агуулдаг бөгөөд нийт 11 популяци байна.
PBMC-г лейкоцитын ялгах бүтээгдэхүүнээс (STEMCELL Technologies) ялгахад Фиколл градиент нягтралын центрифугийг ашигласан. CD8 + Т эсүүдийг PBMC-ээс CD8 MicroBeads (Miltenyi) ашиглан ялгаж, үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу TransAct (Miltenyi) ашиглан бүрэн орчинд 2 долоо хоног өргөжүүлсэн. Эсүүдийг IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) агуулсан бүрэн орчинд 5 хоног байлгаж, дараа нь TransAct-аар дахин өдөөсөн. 7 дахь өдөр үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу хүний ​​CD45 MicroBeads (Miltenyi)-г гурван дараалсан үе шаттайгаар эсийг баяжуулахад ашигласан. Эсүүдийг урсгалын цитометрийн шинжилгээнд (дээр дурдсанчлан) зориулж аликвот хийсэн бөгөөд нэг сая эсийг LC-MS/MS шинжилгээнд гурван удаа аликвот хийсэн. Дээжийг доор дурдсанчлан LC-MS/MS-ээр боловсруулсан. Бид алга болсон метаболитын утгыг 1000 ионы тоогоор тооцоолсон. Дээж бүрийг нийт ионы тоо (TIC)-ээр хэвийн болгож, логарифмын хөрвүүлээд, шинжилгээ хийхээс өмнө MetaboAnalystR дээр автоматаар хэвийн болгоно.
Өвчтөн бүрийн нэг эсийн суспензийг гэсгээж, 40 мкм шүүлтүүрээр шүүж, бүрэн орчинд (дээр дурдсанчлан) оруулсан. Үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу CD8+, CD4+ болон CD45-эсийн дээжийг (мөсөн дээр) баяжуулахын тулд MicroBeads (Miltenyi) ашиглан соронзон бөмбөлгүүдийг ялгах замаар эерэг сонголтын гурван дараалсан үе шатыг ашигласан. Товчхондоо, эсүүдийг эсийн баяжуулалтын буферт (дээр дурдсанчлан) дахин суспензлэж, тоолно. Эсүүдийг хүний ​​CD8 бөмбөлгүүд, хүний ​​CD4 бөмбөлгүүд эсвэл хүний ​​CD45 бөмбөлгүүд (Miltenyi)-ээр 4°C-д 15 минутын турш инкубацилж, дараа нь эсийн баяжуулалтын буфераар угаана. Дээжийг LS багана (Miltenyi)-ээр дамжуулж, эерэг ба сөрөг фракцуудыг цуглуулдаг. Үргэлжлэх хугацааг багасгаж, эсийн нөхөн сэргээх алхамыг хамгийн их байлгахын тулд CD8-фракцийг CD4+ баяжуулалтын хоёр дахь үе шатанд, CD4-фракцийг дараагийн CD45 баяжуулалтад ашиглана. Ялгах үйл явцын туршид уусмалыг мөсөн дээр байлгана.
Метаболит шинжилгээнд дээж бэлтгэхийн тулд эсүүдийг мөстэй хүйтэн давсны уусмалаар нэг удаа угааж, дээж бүрт 1 мл 80% метанол нэмж, дараа нь эргүүлж, шингэн азотод хөлдөөсөн. Дээжийг гурван хөлдөөх-гэсэлтийн мөчлөгт оруулж, 4°C-д 15 минутын турш 14,000 эрг/мин-т центрифугээр халаана. Метаболит агуулсан дээд давхаргыг хуурай болтол ууршуулна. Метаболитуудыг 50 мкл 0.03% шоргоолжны хүчилд дахин уусгаж, эргүүлж холиод дараа нь хог хаягдлыг зайлуулахын тулд центрифугээр халаана.
Дээр дурдсанчлан метаболитуудыг гаргаж авна. Метаболомик судалгаанд зориулж дээд давхаргыг өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн саванд хийнэ. Багцын нөлөөллөөс урьдчилан сэргийлэхийн тулд дээж бүрийг ижил тооны эсээр эмчлэх санамсаргүй эмчилгээний протоколыг ашиглана уу. Бид өмнө нь AB SCIEX QTRAP 5500 Гурвалсан Квадрупол Масс Спектрометр (50) дээр нийтлэгдсэн дэлхийн метаболитуудын чанарын үнэлгээг хийсэн. Хроматографийн шинжилгээ болон оргил хэсгийн интеграцийг MultiQuant хувилбар 2.1 програм хангамж (Applied Biosystems SCIEX) ашиглан гүйцэтгэсэн.
Алга болсон метаболитын утгыг тооцоолоход 1000 ионы тоог ашигласан бөгөөд дээж бүрийн TIC-ийг ашиглан илрүүлсэн метаболит бүрийн хэвийн болгосон оргил талбайг тооцоолж, дээж боловсруулалтаас багажийн шинжилгээгээр оруулсан өөрчлөлтийг залруулсан. TIC-ийг хэвийн болгосны дараа MetaboAnalystR(51) (анхдагч параметр)-ийг логарифмын хөрвүүлэлт болон автомат нормын шугамын масштабжуулалтад ашигладаг. Бид дээжийн төрлүүдийн хоорондох метаболомын ялгааг судлах шинжилгээ хийхийн тулд веган R багцтай PCA-г ашигласан бөгөөд өвчтөнүүдийг шинжлэхийн тулд хэсэгчилсэн нөөцлөлтийн шинжилгээг ашигласан. Дээжүүдийн хоорондох Евклидийн зайг кластерчлахын тулд дулааны газрын зургийн дендрограммыг байгуулахын тулд Уордын аргыг ашигласан. Бид эсийн төрөл болон бичил орчинд ялгаварлан элбэг дэлбэг метаболитыг тодорхойлохын тулд стандартчилагдсан метаболитын элбэг дэлбэг байдал дээр limma (52)-г ашигласан. Тайлбарыг хялбарчлахын тулд бид загварыг тодорхойлохын тулд бүлгийн дундаж параметрийг ашиглаж, бичил орчин дахь эсийн төрлийг бүлэг тус бүрээр авч үзсэн (n = 6 бүлэг); Ач холбогдлын тестийн хувьд бид метаболит тус бүрт гурван удаагийн давтан хэмжилт хийсэн. Хуурамч репликациас зайлсхийхийн тулд өвчтөнийг лимма загварт саад тотгор болгон оруулсан. Өөр өөр өвчтөнүүдийн хоорондох метаболитын ялгааг шалгахын тулд бид өвчтөнүүдийг багтаасан лимма загварыг тогтмол байдлаар тохируулсан. Бид эсийн төрөл ба Padj <0.05 бичил орчны хоорондох урьдчилан тодорхойлсон ялгааны ач холбогдлыг мэдээлдэг (Бенжамини-Хохбергийн залруулга).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% амьдрах чадвар) ашиглан эрч хүчээр баяжуулсны дараа нийт амьд хөлдөөсөн асцит болон хавдрын дээжинд 10x 5'генийн экспрессийн протоколыг ашиглан нэг эсийн транскриптомын дарааллыг хийсэн. Хавдар болон асциттай таарсан таван тохиолдлыг шинжилсэн боловч нэг хавдрын дээжээс авсан амьдрах чадвар бага байсан тул үүнийг оруулахаас сэргийлсэн. Өвчтөнүүдийг олон удаа сонгохын тулд бид өвчтөн бүрийн дээжийг 10x хромын хянагчийн эгнээнд нэгтгэж, асцит болон хавдрын цэгүүдийг тусад нь шинжилсэн. Дарааллыг тогтоосны дараа [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp хос төгсгөл (PE), Квебек геном; Хавдар болон асцитын хувьд эс тус бүрт дунджаар 73,488 ба 41,378 уншилт тус тус гарсан]], бид CellSNP болон Vireo (53)-г ашигласан (CellSNP дээр үндэслэсэн). GRCh38-ийн өгсөн хүний ​​нийтлэг SNP (VCF) нь донорын таних тэмдгийг оноодог. Бид өвчтөний генотипийн төлөв байдлын (IBS) хамгийн ойрын таних тэмдгийг (IBS) тодорхойлохын тулд SNPRelate-г ашигладаг бөгөөд оноогүй эсүүд болон дуплекс гэж тодорхойлогдсон эсүүд болон асцит болон хавдрын дээжийн хооронд тохирох доноруудыг хасдаг (54). Энэ даалгаврын үндсэн дээр бид хавдар болон асцитад эсийн төлөөлөл элбэгтэй гурван тохиолдлыг дараагийн шинжилгээнд хадгалсан. Scater (55) болон scran (56) BioConductor савлагаанд массын шүүлтүүрийн алхам хийсний дараа шинжилгээнд 6975 эс (хавдар болон асцитаас тус тус 2792 ба 4183 эс) гарсан. Бид Жаккардын зайд үндэслэн хамгийн ойрын хөршийн сүлжээний (SNN) igraph-ийн (57) Louvain кластерчлалыг ашигладаг. Экспрессээр кластер эсүүд. Кластеруудыг маркер генийн экспресс дээр үндэслэн таамаглаж буй эсийн төрлүүдэд гараар тэмдэглэж, t-SNE-ээр дүрсэлсэн. Цитотоксик Т эсүүдийг CD8A болон GZMA-ийн экспрессээр тодорхойлдог бөгөөд рибосомын уургийн экспресс багатай дэд кластеруудыг оруулаагүй болно. Бид Izar et al. (16)-ийн нийтлэгдсэн өгөгдөлд хандсан бөгөөд тэдгээрийн t-SNE оруулга нь дархлааны эсийн маркерууд болон NNMT экспрессийн хоорондох экспрессийн давхцлыг хянаж чаддаг.
PBMC-г лейкоцитын ялгах бүтээгдэхүүнээс (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент нягтралын центрифугээр ялгасан. CD3 + эсийг PBMC-ээс CD3 бөмбөлгүүдийг (Miltenyi) ашиглан ялгасан. MNA байгаа эсэхээс үл хамааран CD3 + эсийг хавтантай холбогдсон CD3 (5μg/ml), уусдаг CD28 (3μg/ml) болон IL-2 (300 U/ml; Proleukin)-ээр идэвхжүүлсэн. Тэлэлтийн сүүлийн өдөр амьдрах чадвар (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) болон тархалтыг (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) урсгалын цитометрээр үнэлсэн. PMA (20 нг/мл) болон иономицин (1μг/мл)-аар GolgiStop-оор 4 цагийн турш эсийг өдөөж, CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) болон TNFα-флуоресцеины изотиоцианат (FITC) (MAb11, BD)-г хянаж эффекторын үйл ажиллагааг үнэлнэ. qPCR болон ChIP эсийг PMA (20 нг/мл) болон иономицин (1μг/мл)-аар 4 цагийн турш өдөөнө. ELISA-ийн дээд давхаргыг PMA (20 нг/мл) болон иономицин (1μг/мл)-аар өдөөхөөс өмнө болон дараа 4 цагийн турш цуглуулна.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ашиглан РНХ-г ялгаж авахын тулд үйлдвэрлэгчийн протоколыг дагаж мөрдөнө үү. Дээжийг нэгэн төрлийн болгохын тулд QIAshredder (QIAGEN) ашиглана уу. Нэмэлт ДНХ (cDNA)-г нэгтгэхийн тулд өндөр багтаамжтай РНХ-г cDNA хэрэгсэл (Thermo Fisher Scientific) ашиглана уу. Дараах датчикуудыг ашиглан генийн экспрессийг тоон үзүүлэлтээр (үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу) TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ашиглана уу: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицералдегид-3-фосфатын оф Устөрөгч (GAPDH)] болон Hs01010726_m1 (SLC22A2). Дээжийг MicroAmp оптик хальстай MicroAmp хурдан оптик 96 худгийн урвалын хавтан (Applied Biosystems)-д StepOnePlus бодит цагийн PCR систем (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) дээр ажиллуулсан. 35-аас хэтэрсэн аливаа Ct утга нь илрүүлэлтийн босго хэмжээнээс дээгүүр гэж тооцогддог бөгөөд илрүүлэх боломжгүй гэж тэмдэглэгдсэн.
Өмнө нь тайлбарласны дагуу ChIP-ийг гүйцэтгэнэ (58). Товчхондоо, эсүүдийг формальдегидээр (эцсийн концентраци 1.42%) боловсруулж, өрөөний температурт 10 минут инкубацлав. Нэмэлт хавагнах буфер (25 мМ Хепес, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl ба 0.1% NP-40) мөсөн дээр 10 минут байлгаад, дараа нь тайлбарласны дагуу дархлаа тунадасжуулах буферт дахин уусгана (58). Дараа нь дээжийг дараах мөчлөгүүдээр хэт авиан шинжилгээгээр боловсруулсан: 10 мөчлөг (20 1 секундын импульс) ба 40 секундын статик хугацаа. ChIP зэрэглэлийн иммуноглобулин G (Эсийн дохиоллын технологи; 1μl), гистон H3 (Эсийн дохиоллын технологи; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) болон SP1 (Эсийн дохиоллын технологи; 3μl) эсрэгбиеийг дээжийг 4°CC температурт сэгсэрч, шөнийн турш инкубацлав. А уургийн бөмбөлгүүдийг (Thermo Fisher Scientific) дээжтэй 4°C температурт 1 цагийн турш зөөлөн сэгсэрч өсгөвөрлөж, дараа нь ДНХ-г баяжуулахын тулд chelex бөмбөлгүүдийг (Bio-Rad) ашиглан, уургийг задлахад протеиназа К (Thermo Fisher) ашиглана. TNFα промоторыг ПГУ-аар илрүүлсэн: урагш, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; эсрэгээрээ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp бүтээгдэхүүн). Зургийг Image Lab (Bio-Rad) гаргаж, ImageJ програм хангамж ашиглан тоон үзүүлэлтийг гаргасан.
Эсийн өсгөврийн дээд давхаргыг дээр дурдсанчлан цуглуулсан. Тодорхойлолтыг хүний ​​TNFα ELISA иж бүрдэл (Invitrogen), хүний ​​IL-2 ELISA иж бүрдэл (Invitrogen) болон хүний ​​IFN-γ ELISA иж бүрдэл (Abcam)-ийн үйлдвэрлэгчийн журмын дагуу гүйцэтгэсэн. Үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу дээд давхаргыг TNFα болон IL-2-ийг илрүүлэхийн тулд 1:100 харьцаатай, IFN-γ-ийг илрүүлэхийн тулд 1:3 харьцаатай шингэлсэн. 450 нм-д шингээлтийг хэмжихийн тулд EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) ашиглана уу.
PBMC-г лейкоцитын ялгах бүтээгдэхүүнээс (STEMCELL Technologies) Фиколл градиент нягтралын центрифугээр ялгасан. CD3 + эсийг PBMC-ээс CD3 бөмбөлгүүдийг (Miltenyi) ашиглан ялгасан. MNA байгаа эсэхээс үл хамааран CD3 + эсийг хавтантай холбосон CD3 (5μg/ml), уусдаг CD28 (3μg/ml) болон IL-2 (300 U/ml; Proleukin)-аар 3 хоногийн турш идэвхжүүлсэн. 3 хоногийн дараа эсүүдийг цуглуулж, 0.9% давсны уусмалаар угааж, үрлэн эсийг хөлдөөсөн. Эсийн тооллогыг 123count eBeads ашиглан урсгалын цитометрээр (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R тохиргоо) хийсэн.
Дээр дурдсанчлан метаболитуудыг гаргаж авсан. Хатаасан хандыг 4000 эсийн эквивалент/мкл концентрацид сэргээсэн. Дээжийг урвуу фазын хроматографи (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) болон CORTECS T3 багана (2.1×150 мм, ширхэгийн хэмжээ 1.6-μm, нүх сүвний хэмжээ 120-Å; #186008500, Waters) ашиглан шинжилнэ. Туйлын массын спектрометр (6470, Agilent), үүнд электрошүршигч ионжуулалт эерэг горимд ажилладаг. Хөдөлгөөнт А фаз нь 0.1% шоргоолжны хүчил (H2O-д), хөдөлгөөнт В фаз нь 90% ацетонитрил, 0.1% шоргоолжны хүчил юм. LC градиент нь 100% A-ийн хувьд 0-2 минут, 99% B-ийн хувьд 2-7.1 минут, 99% B-ийн хувьд 7.1-8 минут байна. Дараа нь баганыг хөдөлгөөнт А фазаар 0.6 мл/мин урсгалын хурдаар 3 минутын турш дахин тэнцвэржүүлнэ. Урсгалын хурд 0.4 мл/мин бөгөөд баганын камерыг 50°C хүртэл халаана. Хадгалах хугацаа (RT) болон хувиргалтыг (RT = 0.882 минут, хувиргалт 1 = 137→94.1, хувиргалт 2 = 137→92, хувиргалт 3 = 137→78) тогтоохын тулд MNA-ийн цэвэр химийн стандартыг (M320995, Торонтогийн судалгааны химийн компани, Хойд Йорк, Онтарио, Канад) ашиглана уу. Гурван шилжилт бүгд зөв хадгалах хугацаанд явагдах үед өвөрмөц байдлыг хангахын тулд 1-р шилжилтийг тоон үзүүлэлтэд ашиглана. MNA (Торонто Судалгааны Химийн Компани)-ийн стандарт муруйг үндсэн уусмалыг (1 мг/мл) зургаан удаа дараалан шингэлж, тус тус 0.1, 1.0, 10 ба 100 нг/мл, мөн 1.0 ба 10μг/мл шингэн стандартыг гарган авсан. Илрүүлэлтийн хязгаар нь 1 нг/мл бөгөөд шугаман хариу үйлдэл нь 10 нг/мл ба 10μг/мл хооронд байна. LC/MS шинжилгээнд дээж болон стандартын хоёр микролитр тарилга бүрийг ашигладаг бөгөөд шинжилгээний платформын тогтвортой байдлыг хангахын тулд найман тарилга тутамд чанарын хяналтын холимог дээжийг хийдэг. MNA-аар боловсруулсан бүх эсийн дээжийн MNA хариу үйлдэл нь шинжилгээний шугаман хүрээнд байсан. Өгөгдлийн шинжилгээг MassHunter тоон шинжилгээний програм хангамж (v9.0, Agilent) ашиглан хийсэн.
Хоёр дахь үеийн αFR-CAR бүтцийг Сонг болон бусад (59)-аас авсан. Товчхондоо, уг бүтэц нь дараах агуулгыг агуулна: CD8a удирдагч дараалал, хүний ​​αFR-д өвөрмөц дан гинжин хувьсагчийн фрагмент, CD8a нугас ба трансмембран бүс, CD27 эсийн доторх домэйн болон CD3z эсийн доторх домэйн. Бүрэн CAR дарааллыг GenScript ашиглан нэгтгэж, дараа нь дамжуулалтын үр ашгийг үнэлэхэд ашигласан GFP экспрессийн кассетны дээд хэсэгт байрлах хоёр дахь үеийн лентивирусын экспрессийн вектор руу клончилсон.
Лентивирусыг HEK293T эсийг [Америкийн төрлийн өсгөврийн цуглуулга (ATCC)] трансфекцээр үүсгэдэг; 10% ургийн үхрийн ийлдэс (FBS) болон 1% PenStrep агуулсан Дулбеккогийн өөрчлөгдсөн Ийгл орчинд ургуулж, CAR-GFP вектор болон савлагааны плазмидууд (psPAX2 ба pMD2.G, Addgene) нь липофекцийн амин (Sigma-Aldrich) ашигладаг. Вирус агуулсан дээд давхаргыг трансфекцээс хойш 48 ба 72 цагийн дараа цуглуулж, шүүж, хэт центрифугээр баяжуулсан. Баяжуулсан вирусын дээд давхаргыг -80°C температурт трансдукц хүртэл хадгална.
PBMC-г эрүүл донорын лейкоцитын ялгах бүтээгдэхүүнээс (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент нягтралын центрифугээр ялгадаг. PBMC-ээс CD8+ эсийг ялгахын тулд эерэг сонголтын CD8 микро бөмбөлгүүдийг (Miltenyi) ашиглана. Т эсийг TransAct (Miltenyi) болон TexMACS орчинд [Miltenyi; 3% дулаанаар идэвхгүйжүүлсэн хүний ​​ийлдэс, 1% PenStrep болон IL-2 (300 U/ml)-ээр баяжуулсан] өдөөдөг. Өдөөлт хийснээс хойш 24 цагийн дараа Т эсүүдийг лентивирусаар (106 эс тутамд 10 мкл концентрацитай вирусын дээд давхарга) дамжуулсан. Cytek Aurora дээр (FSC (Урагш тараах)/SSC (Хажуу тараах), Singlet, GFP+ дээр) дамжуулснаас хойш 1-3 хоногийн дараа эсүүдийн GFP экспрессийг үнэлж, дамжуулалтын үр ашгийг дор хаяж 30% байгааг харуулна.
CAR-T эсүүдийг дараах нөхцөлд Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep-ээр баяжуулсан)-д 24 цагийн турш өсгөвөрлөв: боловсруулаагүй, 250 μM аденозин эсвэл 10 mM MNA-аар боловсруулсан. Урьдчилан боловсруулсны дараа CAR-T эсүүдийг PBS-ээр угааж, 20,000 SK-OV-3 эстэй [ATCC; McCoy 5A орчинд (Sigma-Aldrich) 10% FBS болон 1% PenStrep-ээр баяжуулсан: 1-ийн эффектор ба байны харьцааг нэмэлт Immunocult орчинд гурван удаа олшруулсан. SK-OV-3 эсүүд болон digitalis сапонин (0.5мг/мл; Sigma-Aldrich)-аар лизис хийсэн SK-OV-3 эсүүдийг сөрөг болон эерэг хяналтын бүлэг болгон тус тус ашигласан. Хамт тариалснаас хойш 24 цагийн дараа дээд давхаргыг цуглуулж, лактатын дегидрогеназа (LDH)-ийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) хэмжсэн. LDH дээд давхаргыг LDH буферт 1:50 харьцаатайгаар шингэлсэн. Устгах хувийг дараах томъёогоор хэмжсэн: Устгах хувь = залруулгын хувь / хамгийн их устгалын түвшин x 100%, энд залруулгын хувь = зөвхөн хамтарсан өсгөвөр-Т эсүүд, хамгийн их устгалын түвшин = эерэг хяналт-сөрөг хяналт.
Текст эсвэл материал, аргуудад тайлбарласны дагуу статистикийн шинжилгээнд GraphPad Prism 8, Microsoft Excel эсвэл R v3.6.0 ашиглана уу. Хэрэв нэг өвчтөнөөс олон дээж цуглуулсан бол (жишээлбэл, асцит ба хавдар) бид хосолсон t тестийг ашиглах эсвэл өвчтөнийг шугаман эсвэл ерөнхий загварт санамсаргүй нөлөө болгон оруулна. Метаболомик шинжилгээний хувьд ач холбогдлын тестийг гурван удаа хийнэ.
Энэ нийтлэлийн нэмэлт материалыг http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 хаягаар орж үзнэ үү.
Энэ бол Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ийн нөхцлийн дагуу тараасан нээлттэй хандалттай нийтлэл бөгөөд эцсийн хэрэглээ нь арилжааны ашиг олох зорилгоор биш бөгөөд анхны бүтээл зөв байх ёстой гэсэн үндэслэл бүхий аливаа хэрэгслээр ашиглах, түгээх, хуулбарлахыг зөвшөөрдөг. Лавлагаа.
Тэмдэглэл: Бид танаас зөвхөн имэйл хаягаа өгөхийг хүсэж байгаа бөгөөд ингэснээр таны хуудсанд санал болгож буй хүн та имэйлийг харахыг хүсч байгаа бөгөөд энэ нь спам биш гэдгийг мэдэх болно. Бид ямар ч имэйл хаягийг авахгүй.
Энэ асуултыг та зочин эсэхийг шалгах, мөн автоматаар спам илгээхээс урьдчилан сэргийлэхэд ашигладаг.
Мариса К.Килгур (Мариса К.Килгор), Сара МакФерсон (Сарах МакФерсон), Лорен Г.Захариас (Лорен Г.Захариас), Абигаил Эли Арис Г.Уотсон (Х.Уотсон), Жон Стагг (Жон Стагг), Брэд Х.Нелсон (Брэд Х.Ж.Нельсон), Ралди (Брэд Х.Ж.Реф). ДеБерардинис), Рассел Г.Жонс (Расселл Ж. Жонс), Финеас Т.Хэмилтон (Финеас Т.
MNA нь Т эсийн дархлааг дарангуйлахад хувь нэмэр оруулдаг бөгөөд хүний ​​хорт хавдрыг эмчлэх дархлаа эмчилгээний боломжит зорилтыг төлөөлдөг.
Мариса К.Килгур (Мариса К.Килгор), Сара МакФерсон (Сарах МакФерсон), Лорен Г.Захариас (Лорен Г.Захариас), Абигаил Эли Арис Г.Уотсон (Х.Уотсон), Жон Стагг (Жон Стагг), Брэд Х.Нелсон (Брэд Х.Ж.Нельсон), Ралди (Брэд Х.Ж.Реф). ДеБерардинис), Рассел Г.Жонс (Расселл Ж. Жонс), Финеас Т.Хэмилтон (Финеас Т.
MNA нь Т эсийн дархлааг дарангуйлахад хувь нэмэр оруулдаг бөгөөд хүний ​​хорт хавдрыг эмчлэх дархлаа эмчилгээний боломжит зорилтыг төлөөлдөг.
©2021 Америкийн шинжлэх ухааны дэвшлийн нийгэмлэг. бүх эрх хуулиар хамгаалагдсан. AAAS нь HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER хамтлагуудын түнш юм. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.