Пропионы хүчил (PPA) нь мөөгөнцрийн эсрэг бодис бөгөөд хоолны дэглэмийн нийтлэг нэмэлт бодис бөгөөд гэдэсний дисбиозоос үүдэлтэй ходоод гэдэсний үйл ажиллагааны алдагдалтай хамт хулгануудад мэдрэлийн хөгжлийн хэвийн бус байдлыг үүсгэдэг болохыг харуулсан. Хоолны дэглэм дэх PPA-д өртөх болон гэдэсний микробиотын дисбиозын хоорондын холбоог санал болгосон боловч шууд судлаагүй болно. Энд бид дисбиоз үүсгэж болзошгүй гэдэсний микробиотын найрлага дахь PPA-тай холбоотой өөрчлөлтийг судалсан. Эмчилгээ хийгдээгүй (n=9) болон PPA-аар баяжуулсан (n=13) хоолны дэглэм барьсан хулгануудын гэдэсний микробиомыг бичил биетний найрлага болон бактерийн бодисын солилцооны замын ялгааг үнэлэхийн тулд урт хугацааны метагеномик дарааллыг ашиглан дараалуулсан. Хоолны дэглэм дэх PPA нь өмнө нь PPA үйлдвэрлэлд оролцдог байсан хэд хэдэн Bacteroides, Prevotella, Ruminococcus зүйл зэрэг чухал таксоны элбэг дэлбэг байдал нэмэгдсэнтэй холбоотой байв. PPA-д өртсөн хулгануудын микробиом нь липидийн солилцоо болон стероид дааврын биосинтезтэй холбоотой илүү олон замтай байв. Бидний үр дүнгээс харахад PPA нь гэдэсний микробиот болон түүнтэй холбоотой бодисын солилцооны замыг өөрчилж чадна. Эдгээр ажиглагдсан өөрчлөлтүүд нь хэрэглэхэд аюулгүй гэж ангилагдсан хадгалалтын бодисууд нь гэдэсний бичил биетний найрлагад нөлөөлж, улмаар хүний эрүүл мэндэд нөлөөлж болохыг онцолж байна. Тэдгээрийн дотроос шинжилж буй ангиллын түвшингээс хамааран P, G эсвэл S-ийг сонгоно. Хуурамч эерэг ангиллын нөлөөллийг багасгахын тулд 1e-4 (1/10,000 уншлага) гэсэн хамгийн бага харьцангуй элбэгшлийн босгыг баримталсан. Статистикийн шинжилгээ хийхээс өмнө Bracken-ийн мэдээлсэн харьцангуй элбэгшлийг (fraction_total_reads) төвлөрсөн лог-харьцаа (CLR) хувиргалтыг ашиглан хувиргасан (Aitchison, 1982). CLR аргыг өгөгдлийн хувиргалтад сонгосон, учир нь энэ нь масштабаар өөрчлөгддөггүй бөгөөд сийрэг бус өгөгдлийн багцад хангалттай (Gloor et al., 2017). CLR хувиргалт нь натурал логарифмыг ашигладаг. Bracken-ийн мэдээлсэн тооллогын өгөгдлийг харьцангуй лог илэрхийлэл (RLE) ашиглан хэвийн болгосон (Anders and Huber, 2010). Зурагнуудыг matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 болон дараалсан логарифмуудын хослолыг ашиглан үүсгэсэн (Gloor et al., 2017). 0.12.2 ба stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes харьцааг дээж бүрийн хувьд хэвийн болгосон бактерийн тоог ашиглан тооцоолсон. Хүснэгтэд мэдээлсэн утгуудыг 4 аравтын орон хүртэл бөөрөнхийлсөн. Simpson-ы олон янз байдлын индексийг KrakenTools v. 1.2 багцад өгөгдсөн alpha_diversity.py скриптийг ашиглан тооцоолсон (Lu et al., 2022). Bracken тайланг скриптэд өгсөн бөгөөд -an параметрийн хувьд Simpson-ы "Si" индексийг өгсөн болно. Элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг CLR-ийн дундаж ялгаа ≥ 1 эсвэл ≤ -1 гэж тодорхойлсон. CLR-ийн дундаж ялгаа ±1 нь дээжийн төрлийн элбэгшил 2.7 дахин нэмэгдсэнийг илтгэнэ. (+/-) тэмдэг нь таксон нь PPA дээж болон хяналтын дээжинд тус тус илүү элбэг байгаа эсэхийг илтгэнэ. Ач холбогдлыг Манн-Уитни U тестийг ашиглан тодорхойлсон (Виртанен нар, 2020). Statsmodels v. 0.14 (Бенжамини ба Хохберг, 1995; Сийболд ба Перктольд, 2010)-ийг ашигласан бөгөөд олон туршилтыг залруулахын тулд Бенжамини-Хохберг процедурыг хэрэглэсэн. Статистикийн ач холбогдлыг тодорхойлох босго болгон тохируулсан p-утга ≤ 0.05-ийг ашигласан.
Хүний микробиомыг ихэвчлэн "биеийн сүүлчийн эрхтэн" гэж нэрлэдэг бөгөөд хүний эрүүл мэндэд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг (Бакеро болон Номбела, 2012). Ялангуяа гэдэсний микробиом нь системийн хэмжээнд үзүүлэх нөлөө болон олон чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэдгээрээ алдартай. Комменсал бактери нь гэдсэнд элбэг байдаг бөгөөд олон экологийн орон зайг эзэлдэг, шим тэжээлийг ашигладаг, болзошгүй эмгэг төрүүлэгчидтэй өрсөлддөг (Jandhyala et al., 2015). Гэдэсний микробиотын олон янзын бактерийн бүрэлдэхүүн хэсгүүд нь витамин зэрэг чухал шим тэжээлийг үйлдвэрлэх, хоол боловсруулалтыг дэмжих чадвартай (Rowland et al., 2018). Бактерийн метаболитууд нь эдийн хөгжилд нөлөөлж, бодисын солилцоо, дархлааны замыг сайжруулдаг болохыг харуулсан (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Хүний гэдэсний микробиомын найрлага нь маш олон янз бөгөөд хоолны дэглэм, хүйс, эм, эрүүл мэндийн байдал зэрэг генетикийн болон хүрээлэн буй орчны хүчин зүйлээс хамаардаг (Kumbhare et al., 2019).
Эхийн хооллолт нь ураг болон нярайн хөгжлийн чухал бүрэлдэхүүн хэсэг бөгөөд хөгжилд нөлөөлж болзошгүй нэгдлүүдийн таамаглаж буй эх үүсвэр юм (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Ийм сонирхолтой нэгдлүүдийн нэг бол бактерийн исгэлтээс гаргаж авсан богино гинжин тосны хүчлийн дайвар бүтээгдэхүүн бөгөөд хүнсний нэмэлт болох пропионы хүчил (PPA) юм (den Besten et al., 2013). PPA нь нянгийн эсрэг ба мөөгөнцрийн эсрэг үйлчилгээтэй тул хүнсний хадгалалтын бодис болгон ашигладаг бөгөөд хөгц, бактерийн өсөлтийг дарангуйлахын тулд үйлдвэрлэлийн хэрэглээнд ашигладаг (Wemmenhove et al., 2016). PPA нь янз бүрийн эдэд өөр өөр нөлөө үзүүлдэг. Элэгний хувьд PPA нь макрофаг дахь цитокины илэрхийлэлд нөлөөлж үрэвслийн эсрэг үйлчилгээтэй (Kawasoe et al., 2022). Энэхүү зохицуулах нөлөө нь бусад дархлааны эсүүдэд ажиглагдаж, үрэвслийн зохицуулалтыг бууруулдаг (Haase et al., 2021). Гэсэн хэдий ч тархинд эсрэг нөлөө ажиглагдсан. Өмнөх судалгаагаар PPA-д өртөх нь хулганад аутизмтай төстэй зан үйлийг өдөөдөг болохыг харуулсан (El-Ansary et al., 2012). Бусад судалгаагаар PPA нь глиозыг өдөөж, тархинд үрэвслийн замыг идэвхжүүлдэг болохыг харуулсан (Abdelli et al., 2019). PPA нь сул хүчил тул гэдэсний хучуур эдээр дамжин цусны урсгалд тархаж, улмаар цус-тархины саад тотгор болон ихэс зэрэг хязгаарлагдмал саад тотгорыг давж чаддаг (Stinson et al., 2019), энэ нь PPA-г бактерийн үүсгэдэг зохицуулагч метаболит болохын ач холбогдлыг онцолж байна. Аутизмын эрсдэлт хүчин зүйл болох PPA-ийн боломжит үүргийг одоогоор судалж байгаа ч аутизмтай хүмүүст үзүүлэх нөлөө нь мэдрэлийн ялгаварлан гадуурхалтыг өдөөхөөс цааш үргэлжилж магадгүй юм.
Суулгалт, өтгөн хатах зэрэг ходоод гэдэсний шинж тэмдгүүд нь мэдрэлийн хөгжлийн эмгэгтэй өвчтөнүүдэд түгээмэл тохиолддог (Cao et al., 2021). Өмнөх судалгаагаар аутизмын спектрийн эмгэгтэй (ASD) өвчтөнүүдийн микробиом нь эрүүл хүмүүсийнхээс ялгаатай болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь гэдэсний микробиотын дисбиоз байгааг харуулж байна (Finegold et al., 2010). Үүнтэй адил үрэвсэлт гэдэсний өвчин, таргалалт, Альцгеймерийн өвчин гэх мэт өвчтөнүүдийн микробиомын шинж чанар нь эрүүл хүмүүсийнхээс ялгаатай байдаг (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Гэсэн хэдий ч өнөөдрийг хүртэл гэдэсний микробиом болон мэдрэлийн өвчин, шинж тэмдгүүдийн хооронд учир шалтгааны холбоо тогтоогдоогүй байна (Yap et al., 2021), гэхдээ эдгээр өвчний зарим төлөв байдалд хэд хэдэн бактерийн төрөл зүйл нөлөөлдөг гэж үздэг. Жишээлбэл, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio болон бусад төрөл зүйлүүд нь аутизмтай өвчтөнүүдийн микробиотад илүү их байдаг (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Эдгээр төрөл зүйлийн зарим гишүүн зүйлүүд нь PPA үйлдвэрлэхтэй холбоотой гентэй байдаг нь мэдэгдэж байна (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). PPA-ийн нянгийн эсрэг шинж чанарыг харгалзан үзвэл түүний элбэгшлийг нэмэгдүүлэх нь PPA үүсгэдэг бактерийн өсөлтөд ашигтай байж болох юм (Jacobson et al., 2018). Тиймээс PFA-аар баялаг орчин нь гэдэсний микробиотад өөрчлөлт оруулж, түүний дотор ходоод гэдэсний эмгэг төрүүлэгчдийг үүсгэж болзошгүй бөгөөд энэ нь ходоод гэдэсний шинж тэмдэг үүсгэдэг хүчин зүйл байж болно.
Микробиомын судалгааны гол асуулт бол бичил биетний найрлагын ялгаа нь үндсэн өвчний шалтгаан эсвэл шинж тэмдэг мөн эсэх явдал юм. Хоолны дэглэм, гэдэсний микробиом болон мэдрэлийн өвчний хоорондын нарийн төвөгтэй хамаарлыг тодруулах эхний алхам бол хоолны дэглэмийн бичил биетний найрлагад үзүүлэх нөлөөллийг үнэлэх явдал юм. Үүний тулд бид PPA-аар баялаг эсвэл PPA-аар дутагдсан хоол хүнсээр хооллодог хулганы үр удамд гэдэсний микробиомыг харьцуулахын тулд урт уншсан метагеномик дарааллыг ашигласан. Үр удамд эхийнх нь адил хоол хүнсээр хооллосон. Бид PPA-аар баялаг хоол хүнс нь гэдэсний бичил биетний найрлага болон бичил биетний үйл ажиллагааны замд, ялангуяа PPA-ийн солилцоо болон/эсвэл PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой замуудад өөрчлөлт оруулна гэж таамагласан.
Энэхүү судалгаанд Төв Флоридагийн Их Сургуулийн Амьтны Асрамж, Хэрэглээний Хорооны (UCF-IACUC) удирдамжийн дагуу глияд өвөрмөц GFAP промоутерийн хяналтан дор ногоон флуоресцент уураг (GFP)-ийг хэт ихээр илэрхийлдэг FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J трансген хулганууд (Жэксон Лаборатори)-г ашигласан (Амьтан ашиглах зөвшөөрлийн дугаар: PROTO202000002). Хөхнөөс гарсны дараа хулгануудыг тор бүрт хүйс тус бүрээс 1-5 хулганатай торонд тус тусад нь байрлуулсан. Хулгануудыг цэвэршүүлсэн хяналтын хоолны дэглэм (өөрчлөгдсөн нээлттэй шошготой стандарт хоолны дэглэм, 16 ккал% өөх тос) эсвэл натрийн пропионатаар нэмэлт хооллолт (өөрчлөгдсөн нээлттэй шошготой стандарт хоолны дэглэм, 16 ккал% өөх тос, 5000 ppm натрийн пропионат агуулсан)-аар ad libitum-аар тэжээсэн. Ашигласан натрийн пропионатын хэмжээ нь нийт хүнсний жингийн 5000 мг PFA/кг-тай тэнцүү байв. Энэ нь хүнсний хадгалах бодис болгон ашиглахаар батлагдсан PPA-ийн хамгийн өндөр концентраци юм. Энэхүү судалгаанд бэлтгэхийн тулд эх хулгануудыг хээлтүүлэхээс 4 долоо хоногийн өмнө хоёр хоолны дэглэмээр тэжээж, эмэгчний жирэмсний туршид үргэлжлүүлэн хооллосон. Үр төл хулгануудыг [22 хулгана, 9 хяналтын бүлэг (6 эрэгчин, 3 эмэгчин) болон 13 PPA (4 эрэгчин, 9 эмэгчин)] хөхнөөс нь салгаж, дараа нь эмэгчинтэй адил хоолны дэглэмээр 5 сарын турш үргэлжлүүлэн хооллосон. Үр төл хулгануудыг 5 сартайд нь нядалж, гэдэсний ялгадсыг нь цуглуулж, эхлээд 1.5 мл микроцентрифугийн хоолойд -20°C температурт хадгалж, дараа нь эзэн ДНХ шавхагдаж, бичил биетний нуклейн хүчлийг гаргаж авах хүртэл -80°C хөлдөөгчид шилжүүлсэн.
Хост ДНХ-г өөрчилсөн протоколын дагуу (Charalampous et al., 2019) зайлуулсан. Товчхондоо, ялгадсын агууламжийг 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) руу шилжүүлж, хөлдөөсөн байдлаар хадгалсан. Нэг хандлалтад дээд тал нь 1-2 ялгадсын үрэл боловсруулна. Дараа нь ялгадсын агууламжийг хоолой доторх хуванцар пестл ашиглан механик аргаар нэгэн төрлийн болгож, зутан үүсгэнэ. Дээжийг 10,000 RCF-д 5 минут буюу дээж үрэл болтол центрифугээр шахаж, дараа нь дээд давхаргыг соруулж, үрэлийг 250 µl 1× PBS-д дахин уусгана. Эукариот эсийн мембраныг сулруулах угаалгын нунтаг болгон дээжинд 250 µl 4.4% сапонины уусмал (TCI, бүтээгдэхүүний дугаар S0019) нэмнэ. Дээжийг жигд болтол зөөлөн хольж, өрөөний температурт 10 минут инкубацална. Дараа нь, эукариот эсийг задлахын тулд дээжинд 350 мкл нуклеаза агуулаагүй ус нэмж, 30 секундын турш инкубаци хийж, дараа нь 12 мкл 5 М NaCl нэмсэн. Дараа нь дээжийг 6000 RCF-д 5 минутын турш центрифугээр халаана. Дээд давхаргыг соруулж аваад үрлэнг 100 мкл 1X PBS-д дахин уусгана. Хүлээн авагч ДНХ-г арилгахын тулд 100 мкл HL-SAN буфер (12.8568 г NaCl, 4 мл 1М MgCl2, 36 мл нуклеаза агуулаагүй ус) болон 10 мкл HL-SAN фермент (ArticZymes P/N 70910-202) нэмнэ. Дээжийг пипеткээр сайтар хольж, Eppendorf™ ThermoMixer C дээр 37°C температурт 30 минутын турш 800 эрг/мин хурдтайгаар инкубацлав. Инкубацийн дараа 6000 RCF-д 3 минутын турш центрифугээр түлж, 800 µl ба 1000 µl 1X PBS-ээр хоёр удаа угаав. Эцэст нь үрлэн материалыг 100 µl 1X PBS-д дахин уусгана.
Нийт бактерийн ДНХ-г New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) ашиглан ялгасан. Хэрэгсэлд дагалдаж ирсэн стандарт ажиллагааны журмыг бага зэрэг өөрчилсөн. Эцсийн ялгаруулалт хийхийн тулд үйл ажиллагааны өмнө нуклеаза агуулаагүй усыг 60°C-д өсгөвөрлөж, хадгална. Дээж бүрт 10 µl Proteinase K болон 3 µl RNase A нэмнэ. Дараа нь 100 µl Cell Lisis Buffer нэмээд зөөлөн холино. Дараа нь дээжийг Eppendorf™ ThermoMixer C-д 56°C болон 1400 эрг/мин-д дор хаяж 1 цаг, 3 цаг хүртэл өсгөвөрлөнө. Өсгөвөрлөсөн дээжийг 12,000 RCF-д 3 минутын турш центрифугээр түлхэж, дээж бүрийн дээд давхаргыг 400 µл холбох уусмал агуулсан тусдаа 1.5 мл микроцентрифугийн хоолой руу шилжүүлнэ. Дараа нь хоолойг 1 секундын зайтай 5-10 секундын турш импульсийн аргаар эргүүлнэ. Дээж бүрийн шингэний бүх агууламжийг (ойролцоогоор 600–700 µл) урсгалаар цуглуулах хоолойд байрлуулсан шүүлтүүрийн картридж руу шилжүүлнэ. Хоолойг анх ДНХ-тэй холбогдохын тулд 1000 RCF-д 3 минутын турш центрифугээр халааж, дараа нь үлдэгдэл шингэнийг зайлуулахын тулд 12000 RCF-д 1 минутын турш центрифугээр халаана. Дээжийн баганыг шинэ цуглуулах хоолой руу шилжүүлж, дараа нь хоёр удаа угаана. Эхний угаалтанд хоолой бүрт 500 µл угаалгын буфер нэмнэ. Хоолойг 3-5 удаа эргүүлээд дараа нь 12000 RCF-д 1 минутын турш центрифугээр халаана. Цуглуулах хоолойноос шингэнийг асгаж, шүүлтүүрийн картриджийг буцааж цуглуулах хоолой руу хийнэ. Хоёр дахь угаалтанд шүүлтүүрт 500 µл угаалгын буферийг эргүүлэхгүйгээр нэмнэ. Дээжийг 12000 RCF-д 1 минутын турш центрифугээр халаана. Шүүлтүүрийг 1.5 мл-ийн LoBind® хоолой руу шилжүүлж, 100 µл урьдчилан халаасан нуклеаза агуулаагүй ус нэмнэ. Шүүлтүүрийг өрөөний температурт 1 минут инкубацилж, дараа нь 12,000 RCF-д 1 минутын турш центрифугээр түлхэв. Элюцилагдсан ДНХ-г -80°C-д хадгалав.
ДНХ-ийн концентрацийг Qubit™ 4.0 флуорометр ашиглан тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. ДНХ-г үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Qubit™ 1X dsDNA өндөр мэдрэмжит хэрэгсэл (ангиллын дугаар Q33231) ашиглан бэлтгэсэн. ДНХ-ийн хэлтэрхийн уртын тархалтыг Aglient™ 4150 эсвэл 4200 TapeStation ашиглан хэмжсэн. ДНХ-г Agilent™ геномын ДНХ-ийн урвалж (ангиллын дугаар 5067-5366) болон геномын ДНХ-ийн дэлгэцийн хальс (ангиллын дугаар 5067-5365) ашиглан бэлтгэсэн. Номын сангийн бэлтгэлийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) ашиглан гүйцэтгэсэн. ДНХ-г Min106D урсгалын эс (R 9.4.1) бүхий ONT GridION™ Mk1 дарааллын мэдрэгч ашиглан дарааллаар нь тодорхойлсон. Дарааллын тохиргоо нь: өндөр нарийвчлалтай суурь дуудлага, хамгийн бага q утга 9, бар кодын тохиргоо, бар кодын тайралт байв. Дээжийг 72 цагийн турш дарааллаар нь шинжилсний дараа үндсэн дуудлагын өгөгдлийг цаашдын боловсруулалт, шинжилгээнд илгээсэн.
Биоинформатикийн боловсруулалтыг өмнө нь тайлбарласан аргуудыг ашиглан гүйцэтгэсэн (Greenman et al., 2024). Дарааллын аргаар гаргаж авсан FASTQ файлуудыг дээж бүрийн лавлах хэсэгт хуваасан. Биоинформатикийн шинжилгээ хийхээс өмнө өгөгдлийг дараах дамжуулах хоолой ашиглан боловсруулсан: эхлээд дээжийн FASTQ файлуудыг нэг FASTQ файл болгон нэгтгэсэн. Дараа нь 1000 bp-ээс богино уншилтыг Filtlong v. 0.2.1 ашиглан шүүсэн бөгөөд цорын ганц параметр нь –min_length 1000 байсан (Wick, 2024). Цаашид шүүхээс өмнө уншилтын чанарыг NanoPlot v. 1.41.3 ашиглан дараах параметрүүдээр хянасан: –fastq –plots dot –N50 -o
Таксономик ангиллын хувьд уншсан болон угсарсан контигуудыг Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) ашиглан ангилсан. Унших болон угсралтын тайлан болон гаралтын файлуудыг тус тус үүсгэнэ. Унших болон угсралтын шинжилгээ хийхийн тулд –use-names сонголтыг ашиглана уу. Унших сегментүүдэд –gzip-шахсан болон –paired сонголтуудыг тодорхойлсон болно. Метагеном дахь таксоны харьцангуй элбэгшлийг Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) ашиглан тооцоолсон. Бид эхлээд дараах параметрүүдтэй bracken-build ашиглан 1000 суурь агуулсан kmer мэдээллийн санг үүсгэсэн: -d
Генийн тэмдэглэгээ болон харьцангуй элбэгшлийн тооцооллыг Маранга болон бусад судлаачдын тайлбарласан протоколын өөрчилсөн хувилбарыг ашиглан гүйцэтгэсэн (Маранга болон бусад, 2023). Нэгдүгээрт, SeqKit v. 2.5.1 (Шен болон бусад, 2016) ашиглан бүх угсралтаас 500 bp-ээс богино контигуудыг хассан. Дараа нь сонгосон угсралтыг пан-метагеном болгон нэгтгэсэн. Нээлттэй унших хүрээг (ORF) дараах параметрүүдтэй Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3-ийн зэрэгцээ хувилбар) ашиглан тодорхойлсон: -d
Гений замын элбэгшлийг харьцуулахын тулд eggNOG-оор оноогдсон Киотогийн Ген ба Геномын нэвтэрхий толь бичиг (KEGG)-ийн ортолог (KO) танигчуудын дагуу генүүдийг анх бүлэглэсэн. Шинжилгээ хийхээс өмнө нокаутгүй эсвэл олон нокауттай генийг хассан. Дараа нь дээж тус бүрийн KO-ийн дундаж элбэгшлийг тооцоолж, статистикийн шинжилгээ хийсэн. PPA бодисын солилцооны генийг KEGG_Pathway баганад ko00640 мөр оноогдсон аливаа ген гэж тодорхойлсон бөгөөд энэ нь KEGG-ийн дагуу пропионатын бодисын солилцоонд гүйцэтгэх үүргийг харуулсан болно. PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой гэж тодорхойлсон генүүдийг Нэмэлт Хүснэгт 1-д жагсаасан болно (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Дээжийн төрөл бүрт мэдэгдэхүйц илүү элбэг байсан PPA бодисын солилцоо ба үйлдвэрлэлийн генийг тодорхойлохын тулд пермутацийн туршилтыг хийсэн. Шинжилсэн ген бүрийн хувьд мянган пермутаци хийсэн. Статистикийн ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд 0.05 гэсэн p-утгыг хязгаар болгон ашигласан. Кластер доторх төлөөлөх генүүдийн тэмдэглэгээнд үндэслэн кластер доторх бие даасан генүүдэд функциональ тэмдэглэгээг оноож өгсөн. PPA бодисын солилцоо болон/эсвэл PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой таксонуудыг Kraken2 гаралтын файлууд дахь контиг ID-уудыг eggNOG ашиглан функциональ тэмдэглэгээний явцад хадгалагдсан ижил контиг ID-уудтай тохируулснаар тодорхойлж болно. Ач холбогдлын туршилтыг өмнө нь тайлбарласан Манн-Уитни U тестийг ашиглан хийсэн. Олон туршилтын залруулгыг Бенжамини-Хохбергийн процедурыг ашиглан хийсэн. Статистикийн ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд ≤ 0.05 p-утгыг хязгаар болгон ашигласан.
Хулганы гэдэсний микробиомын олон янз байдлыг Симпсоны олон янз байдлын индексийг ашиглан үнэлсэн. Хяналтын болон PPA дээжийн хооронд удам угсаа, зүйлийн олон янз байдлын хувьд мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдаагүй (удам угсааны p-утга: 0.18, зүйлийн p-утга: 0.16) (Зураг 1). Дараа нь бичил биетний найрлагыг үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA) ашиглан харьцуулсан. Зураг 2-т дээжийг тэдгээрийн хэлбэрүүдээр нь бүлэглэж харуулсан бөгөөд энэ нь PPA болон хяналтын дээжийн хооронд микробиомын зүйлийн найрлагад ялгаа байгааг харуулж байна. Энэхүү бүлэглэл нь удам угсааны түвшинд бага тод илэрсэн нь PPA нь тодорхой бактериудад нөлөөлдөг болохыг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 1).
Зураг 1. Хулганы гэдэсний микробиомын төрөл зүйлийн альфа олон янз байдал болон зүйлийн найрлагын. PPA болон хяналтын дээжинд төрөл зүйлийн (A) болон зүйлийн (B) Симпсоны олон янз байдлын индексийг харуулсан хайрцаг диаграммууд. Ач холбогдлыг Манн-Уитни U тест ашиглан тодорхойлж, Бенжамини-Хохбергийн процедурыг ашиглан олон залруулга хийсэн. ns, p-утга нь ач холбогдолгүй байсан (p>0.05).
Зураг 2. Зүйлийн түвшинд хулганы гэдэсний микробиомын найрлагын үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний үр дүн. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний график нь дээжийн эхний хоёр үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн тархалтыг харуулна. Өнгө нь дээжийн төрлийг заана: PPA-д өртсөн хулганууд нил ягаан, хяналтын хулганууд шар өнгөтэй байна. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд 1 ба 2-ыг тус тус x тэнхлэг ба y тэнхлэг дээр байрлуулсан бөгөөд тэдгээрийн тайлбарласан дисперсийн харьцаагаар илэрхийлнэ.
RLE хувиргасан тооллогын өгөгдлийг ашиглан хяналтын болон PPA хулгануудад Бактероид/Бациллийн дундаж харьцаа мэдэгдэхүйц буурсан нь ажиглагдсан (хяналтын: 9.66, PPA: 3.02; p-утга = 0.0011). Энэ ялгаа нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад PPA хулганад Бактероидуудын элбэг дэлбэг байдал өндөр байсантай холбоотой боловч ялгаа нь ач холбогдолгүй байсан (хяналтын дундаж CLR: 5.51, PPA дундаж CLR: 6.62; p-утга = 0.054), харин Бактероидуудын элбэг дэлбэг байдал ижил төстэй байсан (хяналтын дундаж CLR: 7.76, PPA дундаж CLR: 7.60; p-утга = 0.18).
Гэдэсний микробиомын ангилал зүйн гишүүдийн элбэгшлийн шинжилгээгээр PPA болон хяналтын дээжийн хооронд 1 төрөл ба 77 зүйлийн элбэгшил мэдэгдэхүйц ялгаатай байгааг тогтоосон (Нэмэлт Хүснэгт 2). PPA дээжинд 59 зүйлийн элбэгшил хяналтын дээжээс хамаагүй өндөр байсан бол хяналтын дээжинд зөвхөн 16 зүйлийн элбэгшил PPA дээжээс өндөр байв (Зураг 3).
Зураг 3. PPA болон хяналтын хулгануудын гэдэсний микробиом дахь таксоны ялгавартай элбэгшил. Галт уулын графикууд нь PPA болон хяналтын дээжийн хооронд төрөл зүйл (A) эсвэл зүйлийн (B) элбэгшлийн ялгааг харуулж байна. Саарал цэгүүд нь таксоны элбэгшилд мэдэгдэхүйц ялгаа байхгүйг харуулж байна. Өнгөт цэгүүд нь элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (p-утга ≤ 0.05). Дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэгшлийн хамгийн том ялгаа бүхий шилдэг 20 таксоныг улаан, цайвар цэнхэр (хяналтын болон PPA дээж) тус тус харуулав. Шар, нил ягаан цэгүүд нь хяналтын эсвэл PPA дээжинд хяналтын хэсгээс дор хаяж 2.7 дахин их байсан. Хар цэгүүд нь CLR-ийн дундаж зөрүү -1 ба 1 хооронд мэдэгдэхүйц өөр элбэгшилтэй таксоныг илэрхийлнэ. P утгыг Манн-Уитни U тестийг ашиглан тооцоолж, Бенжамини-Хохбергийн процедурыг ашиглан олон удаагийн туршилтад залруулсан. Тод дундаж CLR зөрүү нь элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна.
Гэдэсний бичил биетний найрлагыг шинжилсний дараа бид микробиомын функциональ тэмдэглэгээг хийсэн. Чанар муутай генийг шүүсний дараа бүх дээжинд нийт 378,355 өвөрмөц генийг тодорхойлсон. Эдгээр генийн хувиргасан элбэгшлийг үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээнд (PCA) ашигласан бөгөөд үр дүнгээс харахад функциональ профайл дээр нь үндэслэн дээжийн төрлүүдийн кластер өндөр байгааг харуулсан (Зураг 4).
Зураг 4. Хулганы гэдэсний микробиомын функциональ профайлыг ашиглан PCA үр дүн. PCA график нь дээжийн эхний хоёр үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн тархалтыг харуулна. Өнгө нь дээжийн төрлийг заана: PPA-д өртсөн хулганууд нил ягаан, хяналтын хулганууд шар өнгөтэй байна. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүд 1 ба 2-ыг тус тус x тэнхлэг ба y тэнхлэг дээр байрлуулсан бөгөөд тэдгээрийн тайлбарласан дисперсийн харьцаагаар илэрхийлнэ.
Дараа нь бид янз бүрийн дээжийн төрлүүдэд KEGG нокаутуудын элбэгшлийг судалсан. Нийт 3648 өвөрмөц нокаут тодорхойлогдсон бөгөөд үүнээс 196 нь хяналтын дээжинд мэдэгдэхүйц илүү, 106 нь PPA дээжинд илүү их байсан (Зураг 5). Хяналтын дээжинд нийт 145 ген, PPA дээжинд 61 ген илэрсэн бөгөөд элбэгшлээрээ мэдэгдэхүйц ялгаатай байв. Липид ба амин сахарын солилцоотой холбоотой замууд PPA дээжинд мэдэгдэхүйц илүү баялаг байсан (Нэмэлт Хүснэгт 3). Азотын солилцоо болон хүхрийн релений системтэй холбоотой замууд хяналтын дээжинд мэдэгдэхүйц илүү баялаг байсан (Нэмэлт Хүснэгт 3). Амин сахар/нуклеотидын солилцоо (ko:K21279) болон инозитол фосфатын солилцоо (ko:K07291)-тай холбоотой генийн элбэгшил PPA дээжинд мэдэгдэхүйц өндөр байсан (Зураг 5). Хяналтын дээжинд бензоатын солилцоо (ko:K22270), азотын солилцоо (ko:K00368) болон гликолиз/глюконеогенез (ko:K00131)-тэй холбоотой генүүд мэдэгдэхүйц их байсан (Зураг 5).
Зураг. 5. PPA болон хяналтын хулгануудын гэдэсний микробиом дахь KO-ийн ялгавартай элбэгшил. Галт уулын график нь функциональ бүлгүүдийн (KO) элбэгшлийн ялгааг харуулж байна. Саарал цэгүүд нь дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэгшил нь мэдэгдэхүйц ялгаатай биш KO-г заана (p-утга > 0.05). Өнгөт цэгүүд нь элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг заана (p-утга ≤ 0.05). Дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэгшлийн хамгийн том ялгаатай 20 KO-г улаан, цайвар цэнхэр өнгөөр харуулсан бөгөөд энэ нь хяналтын болон PPA дээжүүдэд тус тус харгалзах болно. Шар, нил ягаан цэгүүд нь хяналтын болон PPA дээжүүдэд тус тус дор хаяж 2.7 дахин их байсан KO-г заана. Хар цэгүүд нь CLR-ийн дундаж зөрүү -1 ба 1-ийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай элбэгшилтэй KO-г заана. P утгыг Манн-Уитни U тестийг ашиглан тооцоолж, Бенжамини-Хохбергийн процедурыг ашиглан олон харьцуулалтад тохируулсан. NaN нь KO нь KEGG-ийн замд хамаарахгүй болохыг заана. Тод дундаж CLR зөрүүний утга нь элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг заана. Жагсаалтад орсон KO-ууд хамаарах замуудын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг Нэмэлт Хүснэгт 3-аас үзнэ үү.
Тэмдэглэгээтэй генүүдийн дунд 1601 ген нь дээжийн төрлүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай элбэгшилтэй байсан (p ≤ 0.05) бөгөөд ген бүр дор хаяж 2.7 дахин их байсан. Эдгээр генүүдээс хяналтын дээжинд 4 ген, PPA дээжинд 1597 ген илүү их байсан. PPA нь нянгийн эсрэг шинж чанартай тул бид дээжийн төрлүүдийн хооронд PPA бодисын солилцоо болон үйлдвэрлэлийн генийн элбэгшлийг судалсан. PPA бодисын солилцоотой холбоотой 1332 генийн дунд хяналтын дээжинд 27 ген, PPA дээжинд 12 ген илүү их байсан. PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой 223 генийн дунд PPA дээжинд 1 ген илүү их байсан. Зураг 6А нь PPA бодисын солилцоонд оролцдог генийн элбэгшил өндөр байгааг харуулж байгаа бөгөөд хяналтын дээжинд элбэгшил өндөр, эффектийн хэмжээ их байгааг харуулж байгаа бол Зураг 6B нь PPA дээжинд элбэгшил мэдэгдэхүйц өндөр ажиглагдсан бие даасан генийг онцолсон.
Зураг. 6. Хулганы гэдэсний микробиом дахь PPA-тай холбоотой генийн ялгавартай элбэгшил. Галт уулын графикууд нь PPA-ийн солилцоо (A) болон PPA үйлдвэрлэл (B)-тэй холбоотой генийн элбэгшлийн ялгааг харуулдаг. Саарал цэгүүд нь дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэгшил нь мэдэгдэхүйц ялгаатай биш генүүдийг заана (p-утга > 0.05). Өнгөт цэгүүд нь элбэгшлийн мэдэгдэхүйц ялгааг заана (p-утга ≤ 0.05). Элбэгшлийн хамгийн том ялгаатай 20 генийг улаан, цайвар цэнхэр өнгөөр (хяналтын болон PPA дээж) тус тус харуулав. Шар, нил ягаан цэгүүдийн элбэгшил нь хяналтын болон PPA дээжинд хяналтын дээжээс дор хаяж 2.7 дахин их байсан. Хар цэгүүд нь CLR-ийн дундаж зөрүү нь -1 ба 1-ийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай элбэгшилтэй генүүдийг илэрхийлнэ. P утгыг Манн-Уитни U тестийг ашиглан тооцоолж, Бенжамини-Хохбергийн процедурыг ашиглан олон харьцуулалтыг зассан. Генүүд нь илүүдэл бус генийн каталог дахь төлөөлөх генүүдтэй тохирч байна. Генийн нэрс нь KO генийг илэрхийлсэн KEGG тэмдэгээс бүрдэнэ. Тод дундаж CLR ялгаа нь мэдэгдэхүйц ялгаатай элбэгшлийг заана. Зураас (-) нь KEGG мэдээллийн санд генийн тэмдэг байхгүй байгааг илтгэнэ.
PPA бодисын солилцоо болон/эсвэл үйлдвэрлэлтэй холбоотой гентэй таксономийн ижил төстэй байдлыг генийн контиг ID-тай тохируулснаар тодорхойлсон. Удам угсааны түвшинд 130 төрөл зүйл нь PPA бодисын солилцоотой холбоотой гентэй, 61 төрөл зүйл нь PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой гентэй байсан (Нэмэлт Хүснэгт 4). Гэсэн хэдий ч ямар ч төрөл зүйл элбэгшлийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгаа үзүүлээгүй (p > 0.05).
Зүйлийн түвшинд 144 бактерийн төрөл зүйл нь PPA бодисын солилцоотой холбоотой гентэй, 68 бактерийн төрөл зүйл нь PPA үйлдвэрлэлтэй холбоотой гентэй байсан нь тогтоогдсон (Нэмэлт Хүснэгт 5). PPA метаболизаторуудын дунд найман бактери нь дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэг дэлбэг байдал мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн бөгөөд бүгд үр нөлөөний хувьд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гарсан (Нэмэлт Хүснэгт 6). Элбэг дэлбэг байдлын хувьд мэдэгдэхүйц ялгаатай бүх PPA метаболизаторууд PPA дээжинд илүү их байсан. Зүйлийн түвшний ангилалд хэд хэдэн Bacteroides болон Ruminococcus төрөл зүйл, мөн Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus, болон Alcaligenes polymorpha зэрэг дээжийн төрлүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаагүй төрөл зүйлүүдийн төлөөлөгчид илэрсэн. PPA үүсгэдэг бактерийн дунд дөрвөн бактери нь дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэг дэлбэг байдал мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан. Элбэг дэлбэг байдлын хувьд мэдэгдэхүйц ялгаатай зүйлүүдэд Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis, болон Ruminococcus bovis багтсан.
Энэхүү судалгаанд бид хулганы гэдэсний микробиотод PPA-д өртөх нь нөлөөллийг судалсан. PPA нь тодорхой зүйлийн үүсгэгч, бусад зүйлийн хүнсний эх үүсвэр болгон ашигладаг, эсвэл нянгийн эсрэг үйлчилгээтэй тул бактерид өөр өөр хариу үйлдэл үзүүлдэг. Тиймээс хоол тэжээлийн нэмэлт тэжээлээр дамжуулан гэдэсний орчинд нэмэх нь тэсвэр тэвчээр, мэдрэмтгий байдал, шим тэжээлийн эх үүсвэр болгон ашиглах чадвараас хамааран өөр өөр нөлөө үзүүлдэг. Мэдрэмтгий бактерийн төрлүүдийг устгаж, PPA-д илүү тэсвэртэй эсвэл хүнсний эх үүсвэр болгон ашиглах чадвартай төрлөөр сольж болох бөгөөд энэ нь гэдэсний микробиотын найрлагад өөрчлөлт оруулахад хүргэдэг. Бидний үр дүнгээс харахад бичил биетний найрлагад мэдэгдэхүйц ялгаа гарсан боловч бичил биетний нийт олон янз байдалд ямар ч нөлөө үзүүлээгүй. Хамгийн том нөлөө нь зүйлийн түвшинд ажиглагдсан бөгөөд PPA болон хяналтын дээжийн хооронд 70 гаруй таксоны элбэгшил мэдэгдэхүйц ялгаатай байв (Нэмэлт Хүснэгт 2). PPA-д өртсөн дээжийн найрлагыг цаашид үнэлэхэд өртөөгүй дээжтэй харьцуулахад бичил биетний төрөл зүйлийн олон янз байдал илүү их байгааг харуулсан бөгөөд энэ нь PPA нь бактерийн өсөлтийн шинж чанарыг сайжруулж, PPA-аар баялаг орчинд амьдрах чадвартай бактерийн популяцийг хязгаарлаж болзошгүйг харуулж байна. Тиймээс PPA нь гэдэсний бичил биетний олон янз байдлыг өргөн хүрээнд тасалдуулахын оронд сонголтоор өөрчлөлтийг өдөөж болно.
PPA зэрэг хүнсний хадгалалтын бодисууд нь гэдэсний микробиомын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн элбэгшлийг нийт олон янз байдалд нөлөөлөхгүйгээр өөрчилдөг болохыг өмнө нь харуулсан (Nagpal et al., 2021). Энд бид PPA-д өртсөн хулгануудад мэдэгдэхүйц хэмжээгээр баялаг байсан Bacteroidetes (өмнө нь Bacteroidetes гэгддэг байсан) төрлийн Bacteroidetes зүйлийн хоорондох хамгийн гайхалтай ялгааг ажигласан. Bacteroidetes зүйлийн элбэгшил нэмэгдэх нь салстын задрал нэмэгдэхтэй холбоотой бөгөөд энэ нь халдварын эрсдэлийг нэмэгдүүлж, үрэвслийг өдөөж болзошгүй юм (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Нэгэн судалгаагаар Bacteroides fragilis-ээр эмчилсэн нярайн эрэгчин хулганууд аутизмын спектрийн эмгэг (ASD)-ийг санагдуулам нийгмийн зан үйлийг харуулсан болохыг тогтоосон (Carmel et al., 2023), бусад судалгаагаар Bacteroides зүйл нь дархлааны үйл ажиллагааг өөрчилж, аутоиммун үрэвслийн кардиомиопатид хүргэдэг болохыг харуулсан (Gil-Cruz et al., 2019). Ruminococcus, Prevotella, Parabacteroides төрөлд хамаарах зүйлүүд PPA-д өртсөн хулгануудад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Coretti et al., 2018). Зарим Ruminococcus төрөл зүйлүүд нь үрэвслийн эсрэг цитокин үүсгэх замаар Кроны өвчин зэрэг өвчинтэй холбоотой байдаг (Henke et al., 2019), харин Prevotella humani зэрэг Prevotella төрөл зүйлүүд нь цусны даралт ихсэх, инсулины мэдрэг чанар зэрэг бодисын солилцооны өвчинтэй холбоотой байдаг (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Эцэст нь бид Bacteroidetes зүйлийн нийт элбэг дэлбэг байдлаас шалтгаалан PPA-д өртсөн хулгануудад Bacteroidetes (өмнө нь Firmicutes гэгддэг байсан) ба Bacteroidetes-ийн харьцаа хяналтын хулгануудтай харьцуулахад мэдэгдэхүйц бага байгааг тогтоосон. Энэ харьцаа нь өмнө нь гэдэсний гомеостазын чухал үзүүлэлт болох нь батлагдсан бөгөөд энэ харьцааны гажуудал нь янз бүрийн өвчний төлөв байдалтай холбоотой байсан (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), түүний дотор үрэвсэлт гэдэсний өвчинтэй холбоотой байсан (Stojanov et al., 2020). Нийтдээ Bacteroidetes төрлийн зүйлүүд нь хоол тэжээлийн өндөр PPA-д хамгийн их өртдөг бололтой. Энэ нь PPA-д илүү тэсвэртэй байх эсвэл PPA-г эрчим хүчний эх үүсвэр болгон ашиглах чадвартай холбоотой байж болох бөгөөд энэ нь дор хаяж нэг зүйл болох Hoylesella enocea-д үнэн болохыг харуулсан (Hitch et al., 2022). Эсвэл эхийн PPA-д өртөх нь хулганы үр удамд Bacteroidetes колоничлолд илүү өртөмтгий болгосноор ургийн хөгжлийг сайжруулж болно; гэсэн хэдий ч бидний судалгааны загвар ийм үнэлгээ хийхийг зөвшөөрөөгүй.
Метагеномик агуулгын үнэлгээгээр PPA-ийн солилцоо болон үйлдвэрлэлтэй холбоотой генийн элбэг дэлбэг байдалд мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдсан бөгөөд PPA-д өртсөн хулганууд PPA үйлдвэрлэлийг хариуцдаг генийн элбэг дэлбэг байдлыг харуулсан бол PPA-д өртөөгүй хулганууд PAA-ийн солилцоог хариуцдаг генийн элбэг дэлбэг байдлыг харуулсан (Зураг 6). Эдгээр үр дүнгээс харахад PPA-ийн бичил биетний найрлагад үзүүлэх нөлөө нь зөвхөн түүний хэрэглээтэй холбоотой биш байж болох юм, эс тэгвээс PPA-ийн солилцоотой холбоотой генийн элбэг дэлбэг байдал нь PPA-д өртсөн хулгануудын гэдэсний микробиомд илүү их элбэг дэлбэг байдлыг харуулах ёстой байсан. Нэг тайлбар нь PPA нь бактерийн элбэг дэлбэг байдлыг бактерийн тэжээл болгон ашиглахаас илүүтэйгээр нянгийн эсрэг үр нөлөөгөөр нь зуучилдаг явдал юм. Өмнөх судалгаагаар PPA нь тунгаас хамааралтай байдлаар Salmonella Typhimurium-ийн өсөлтийг дарангуйлдаг болохыг харуулсан (Жэйкобсон нар, 2018). PPA-ийн өндөр концентрацид өртөх нь түүний нянгийн эсрэг шинж чанарт тэсвэртэй бактерийг сонгож, түүнийг задлан шинжлэх эсвэл үйлдвэрлэх боломжгүй байж болно. Жишээлбэл, хэд хэдэн Parabacteroides зүйл PPA дээжинд мэдэгдэхүйц өндөр элбэг дэлбэг байдалтай байсан ч PPA бодисын солилцоо эсвэл үйлдвэрлэлтэй холбоотой ген илрээгүй (Нэмэлт хүснэгт 2, 4, 5). Цаашилбал, исгэх дайвар бүтээгдэхүүн болох PPA үйлдвэрлэл нь янз бүрийн бактерийн дунд өргөн тархсан байдаг (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Бактерийн олон янз байдал өндөр байгаа нь хяналтын дээжинд PPA бодисын солилцоотой холбоотой генийн элбэг дэлбэг байдлын шалтгаан байж болох юм (Averina et al., 2020). Цаашилбал, 1332 генийн зөвхөн 27 (2.14%) нь зөвхөн PPA бодисын солилцоотой холбоотой генүүд гэж таамаглаж байсан. PPA бодисын солилцоотой холбоотой олон ген нь бусад бодисын солилцооны замд оролцдог. Энэ нь хяналтын дээжинд PPA бодисын солилцоонд оролцдог генийн элбэг дэлбэг байдал өндөр байгааг харуулж байна; эдгээр генүүд нь PPA-г дайвар бүтээгдэхүүн болгон ашиглах эсвэл үүсгэхэд хүргэдэггүй замд ажиллаж болно. Энэ тохиолдолд PPA үүсгэхтэй холбоотой зөвхөн нэг ген нь дээжийн төрлүүдийн хооронд элбэг дэлбэг байдлын хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг харуулсан. PPA бодисын солилцоотой холбоотой генүүдээс ялгаатай нь PPA үйлдвэрлэх маркер генүүдийг сонгосон, учир нь тэдгээр нь PPA үйлдвэрлэх бактерийн замд шууд оролцдог. PPA-д өртсөн хулгануудад бүх зүйл PPA үйлдвэрлэх элбэгшил болон чадавхи мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн нь тогтоогдсон. Энэ нь PPA нь PPA үйлдвэрлэгчдийг сонгож, улмаар PPA үйлдвэрлэлийн хүчин чадал нэмэгдэх болно гэсэн таамаглалыг дэмжиж байна. Гэсэн хэдий ч генийн элбэгшил нь генийн илэрхийлэлтэй заавал хамааралтай байдаггүй; тиймээс хяналтын дээжинд PPA бодисын солилцоотой холбоотой генийн элбэгшил өндөр байгаа ч илэрхийлэлийн түвшин өөр байж болно (Ши нар, 2014). PPA үүсгэдэг генийн тархалт болон PPA үйлдвэрлэлийн хоорондын хамаарлыг баталгаажуулахын тулд PPA үйлдвэрлэхэд оролцдог генийн илэрхийлэлийн судалгаа шаардлагатай байна.
PPA болон хяналтын метагеномын функциональ тэмдэглэгээ нь зарим ялгааг илэрсэн. Генийн агууламжийн PCA шинжилгээгээр PPA болон хяналтын дээжийн хоорондох салангид кластерууд илэрсэн (Зураг 5). Дээж доторх кластерчлал нь хяналтын генийн агууламж илүү олон янз байсан бол PPA дээжүүд хоорондоо кластерлагдсан болохыг харуулсан. Генийн агууламжаар кластерчлал нь зүйлийн найрлагаар кластерчлалтай харьцуулах боломжтой байв. Тиймээс замын элбэгшлийн ялгаа нь тэдгээрийн доторх тодорхой зүйл, омгийн элбэгшлийн өөрчлөлттэй нийцэж байна. PPA дээжинд элбэгшлийн мэдэгдэхүйц өндөр хоёр зам нь амин сахар/нуклеотидын чихрийн солилцоо (ko:K21279) болон олон липидийн солилцооны замуудтай (ko:K00647, ko:K03801; Нэмэлт Хүснэгт 3) холбоотой байв. ko:K21279-тэй холбоотой генүүд нь PPA дээжинд зүйлийн тоо мэдэгдэхүйц өндөр байдаг төрөл зүйлийн нэг болох Bacteroides төрөлтэй холбоотой болох нь мэдэгдэж байна. Энэ фермент нь капсул полисахаридыг илэрхийлснээр дархлааны хариу урвалаас зайлсхийж чаддаг (Wang et al., 2008). Энэ нь PPA-д өртсөн хулгануудад ажиглагдсан бактериоидуудын өсөлтийг тайлбарлаж болох юм. Энэ нь PPA микробиомд ажиглагдсан өөх тосны хүчлийн нийлэгжилт нэмэгдсэнийг нөхөж байна. Бактери нь FASIIko:K00647 (fabB) замыг ашиглан өөх тосны хүчил үүсгэдэг бөгөөд энэ нь эзэн биеийн бодисын солилцооны замд нөлөөлж болзошгүй (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020) бөгөөд липидийн солилцооны өөрчлөлт нь мэдрэлийн хөгжилд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг (Yu et al., 2020). PPA дээжинд элбэгших нь нэмэгдэж байгааг харуулсан өөр нэг зам бол стероидын дааврын биосинтез байв (ko:K12343). Гэдэсний микробиотын дааврын түвшинд нөлөөлөх болон дааврын нөлөөнд автах чадварын хооронд урвуу хамаарал байдаг гэсэн нотолгоо улам бүр нэмэгдэж байгаа бөгөөд ингэснээр стероидын түвшин өндөр байх нь эрүүл мэндэд сөрөг нөлөө үзүүлж болзошгүй юм (Tetel et al., 2018).
Энэхүү судалгаа нь хязгаарлалт, анхаарах зүйлсгүй биш юм. Чухал ялгаа нь бид амьтдын физиологийн үнэлгээг хийгээгүй явдал юм. Тиймээс микробиомын өөрчлөлт нь ямар нэгэн өвчинтэй холбоотой эсэхийг шууд дүгнэх боломжгүй юм. Өөр нэг анхаарах зүйл бол энэхүү судалгаанд хамрагдсан хулгануудыг эхийнхээ адил хооллож байсан явдал юм. Ирээдүйн судалгаагаар PPA-аар баялаг хоолны дэглэмээс PPA-гүй хоолны дэглэм рүү шилжих нь микробиомд үзүүлэх нөлөөг сайжруулж байгаа эсэхийг тодорхойлж магадгүй юм. Бусад олон судалгааны нэгэн адил бидний судалгааны нэг хязгаарлалт бол хязгаарлагдмал түүврийн хэмжээ юм. Хэдийгээр хүчин төгөлдөр дүгнэлт гаргаж болох ч түүврийн хэмжээ том байх нь үр дүнг шинжлэхэд илүү их статистикийн хүч өгөх болно. Мөн бид гэдэсний микробиомын өөрчлөлт болон аливаа өвчний хоорондын хамаарлын талаар дүгнэлт гаргахдаа болгоомжтой ханддаг (Yap et al., 2021). Нас, хүйс, хоолны дэглэм зэрэг төөрөгдүүлэх хүчин зүйлүүд нь бичил биетний найрлагад мэдэгдэхүйц нөлөөлж болно. Эдгээр хүчин зүйлүүд нь гэдэсний микробиомыг нарийн төвөгтэй өвчинтэй холбосонтой холбоотой уран зохиолд ажиглагдсан зөрүүг тайлбарлаж магадгүй юм (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Жишээлбэл, Bacteroidetes төрлийн гишүүд нь ASD-тэй амьтан, хүнд ихэссэн эсвэл буурсан болохыг харуулсан (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Үүнтэй адил үрэвсэлт гэдэсний өвчтэй өвчтөнүүдийн гэдэсний найрлагын судалгаагаар ижил таксонд ихэссэн болон буурсан аль алиныг нь тогтоосон (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Хүйсийн ялгаварлан гадуурхалтын нөлөөллийг хязгаарлахын тулд бид хүйсийн тэгш төлөөллийг хангахыг хичээсэн бөгөөд ингэснээр ялгаа нь хоолны дэглэмээс үүдэлтэй байх магадлалтай. Үйл ажиллагааны тэмдэглэгээний нэг бэрхшээл бол илүүдэл генийн дарааллыг арилгах явдал юм. Бидний генийн кластерчлалын арга нь хуурамч кластерчлалыг арилгахын тулд дарааллын 95% ижил төстэй байдал, 85% уртын ижил төстэй байдал, мөн 90% тэгш байдлын хамрах хүрээ шаарддаг. Гэсэн хэдий ч зарим тохиолдолд бид ижил тэмдэглэгээтэй COG-ийг ажигласан (жишээ нь, MUT) (Зураг 6). Эдгээр ортологууд нь ялгаатай, тодорхой төрөл зүйлтэй холбоотой эсэхийг, эсвэл энэ нь генийн кластерчлалын аргын хязгаарлалт мөн эсэхийг тодорхойлохын тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна. Үйл ажиллагааны тэмдэглэгээний өөр нэг хязгаарлалт бол буруу ангилах магадлалтай; бактерийн ген mmdA нь пропионатын нийлэгжилтэд оролцдог мэдэгдэж буй фермент боловч KEGG нь үүнийг пропионатын бодисын солилцооны замтай холбодоггүй. Үүний эсрэгээр scpB болон mmcD ортологууд нь холбоотой байдаг. Тодорхойлсон нокаутгүй олон тооны генүүд нь генийн элбэгшлийг үнэлэхдээ PPA-тай холбоотой генийг тодорхойлох боломжгүй байдалд хүргэж болзошгүй юм. Ирээдүйн судалгаанууд нь гэдэсний микробиотын үйл ажиллагааны шинж чанарыг илүү гүнзгий ойлгож, генийн илэрхийлэлийг дараагийн урсгалын болзошгүй нөлөөллүүдтэй холбож чадах метатранскриптомын шинжилгээнээс ашиг тус хүртэх болно. Мэдрэлийн хөгжлийн тодорхой эмгэг эсвэл үрэвсэлт гэдэсний өвчинтэй холбоотой судалгаануудын хувьд микробиомын найрлага дахь өөрчлөлтийг эдгээр эмгэгүүдтэй холбохын тулд амьтдын физиологийн болон зан үйлийн үнэлгээ хийх шаардлагатай байна. Гэдэсний микробиомыг үр хөврөлгүй хулганад шилжүүлэн суулгах нэмэлт судалгаа нь микробиом нь өвчний хөдөлгөгч хүч эсвэл шинж чанар мөн эсэхийг тодорхойлоход ашигтай байх болно.
Товчхондоо, бид хоолны дэглэмийн PPA нь гэдэсний бичил биетний найрлагыг өөрчлөх хүчин зүйл болдог болохыг харуулсан. PPA нь FDA-аар батлагдсан хадгалалтын бодис бөгөөд удаан хугацаанд хэрэглэвэл гэдэсний хэвийн микрофлорыг алдагдуулж болзошгүй янз бүрийн хоолонд өргөн хэрэглэгддэг. Бид хэд хэдэн бактерийн элбэгшлийн өөрчлөлтийг олж мэдсэн бөгөөд энэ нь PPA нь гэдэсний бичил биетний найрлагад нөлөөлж болохыг харуулж байна. Микробиотын өөрчлөлт нь тодорхой бодисын солилцооны замын түвшинд өөрчлөлт оруулж, улмаар биеийн эрүүл мэндэд хамааралтай физиологийн өөрчлөлтөд хүргэж болзошгүй юм. Хоол тэжээлийн PPA нь бичил биетний найрлагад үзүүлэх нөлөө нь дисбиоз эсвэл бусад өвчинд хүргэж болзошгүй эсэхийг тодорхойлохын тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна. Энэхүү судалгаа нь PPA нь гэдэсний найрлагад хэрхэн нөлөөлж болох талаарх ирээдүйн судалгааны үндэс суурийг тавьж байна.
Энэхүү судалгаанд үзүүлсэн өгөгдлийн багцууд нь онлайн сангуудаас авах боломжтой. Сангийн нэр болон нэвтрэх дугаар нь: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Энэхүү амьтны судалгааг Төв Флоридагийн Их Сургуулийн Амьтдыг арчлах, ашиглах байгууллагын хороо (UCF-IACUC) баталсан (Амьтан ашиглах зөвшөөрлийн дугаар: PROTO202000002). Энэхүү судалгаа нь орон нутгийн хууль тогтоомж, журам, байгууллагын шаардлагыг хангасан болно.
НГ: Ойлголт, Өгөгдөл цуглуулах, Албан ёсны шинжилгээ, Судалгаа, Арга зүй, Програм хангамж, Дүрслэл, Бичих (анхны ноорог), Бичих (хянах ба засварлах). ЛА: Ойлголт, Өгөгдөл цуглуулах, Арга зүй, Нөөц, Бичих (хянах ба засварлах). SH: Албан ёсны шинжилгээ, Програм хангамж, Бичих (хянах ба засварлах). SA: Судлах, Бичих (хянах ба засварлах). Ерөнхий шүүгч: Судлах, Бичих (хянах ба засварлах). SN: Ойлголт, Төслийн удирдлага, Нөөц, Хяналт, Бичих (хянах ба засварлах). TA: Ойлголт, Төслийн удирдлага, Хяналт, Бичих (хянах ба засварлах).
Зохиогчид энэхүү нийтлэлийн судалгаа, зохиогч болон/эсвэл хэвлүүлэхэд санхүүгийн дэмжлэг аваагүй гэж мэдэгдсэн.
Зохиогчид судалгааг ашиг сонирхлын зөрчил гэж үзэж болох ямар нэгэн арилжааны болон санхүүгийн харилцаа холбоогүй үед явуулсан гэж мэдэгдэж байгаа бөгөөд энэ нь хамаарахгүй.
Энэ нийтлэлд илэрхийлэгдсэн бүх санал бодол нь зөвхөн зохиогчдынх бөгөөд тэдний байгууллага, хэвлэн нийтлэгч, редактор эсвэл шүүмжлэгчдийн үзэл бодлыг заавал тусгасан байх албагүй. Энэ нийтлэлд үнэлэгдсэн аливаа бүтээгдэхүүн, эсвэл үйлдвэрлэгчдийн гаргасан аливаа мэдэгдлийг хэвлэн нийтлэгч баталгаажуулж, дэмжихгүй.
Энэ нийтлэлийн нэмэлт материалыг онлайнаар олж болно: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абделли Л.С., Самсам А., Нассер С.А. (2019). Пропионы хүчил нь аутизмын спектрийн эмгэгийн үед PTEN/AKT замыг зохицуулснаар глиоз ба мэдрэлийн үрэвслийг өдөөдөг. Шинжлэх ухааны тайлан 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Найрлагын өгөгдлийн статистик шинжилгээ. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Ж, Квон Х, Ким ЮЖ (2023). Хөхний хорт хавдрын эрсдэлт хүчин зүйл болох фирмикут/бактериоидетийн харьцаа. Клиникийн анагаах ухааны сэтгүүл, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Дарааллын тооллын өгөгдлийн дифференциал илэрхийллийн шинжилгээ. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анжелис, MD, Пикколо, М., Ваннини, Л., Сирагуса, С., Жиакомо, А.Д., Серразанетти, ДИ, нар. (2013). Өөрөөр заагаагүй аутизм болон нийтлэг хөгжлийн эмгэгтэй хүүхдүүдийн ялгадсын микробиота ба метаболом. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина О.В., Ковтун А.С., Полякова С.И., Савилова А.М., Ребриков Д.В., Даниленко В.Н. (2020). Аутизмын спектрийн эмгэгтэй бага насны хүүхдүүдийн гэдэсний микробиотын бактерийн мэдрэлийн бодисын солилцооны шинж чанар. Анагаах ухааны микробиологийн сэтгүүл 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиом нь хүний эрхтэн. Клиникийн микробиологи ба халдвар 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дюрре П. (2023). Пропионы хүчил үүсгэдэг бактерийн физиологийн талаарх шинэ ойлголтууд: Anaerotignum propionicum ба Anaerotignum neopropionicum (өмнө нь Clostridium propionicum ба Clostridium neopropionicum). Бичил биетүүд 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Эхийн хоол тэжээл, ургийн хөгжил. Ж Нутр. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Бенжамини, Ю., болон Хохберг, Ж. (1995). Хуурамч эерэг түвшинг хянах нь: Олон удаагийн шинжилгээнд практик бөгөөд үр дүнтэй арга барил. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Нийтэлсэн цаг: 2025 оны 4-р сарын 18