Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд бид үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулах болно.
Сээр нуруутан амьтдаас ялгаатай нь шавьжнууд эр бэлгийн стероидын дааврууд дутагдалтай байдаг гэж өргөнөөр үздэг. Anopheles gambiae-д экдизон стероид 20-гидроксиэкдизон (20E) нь эмэгчин2 нийлэгжих үед өндгөн эсийн хөгжлийг хянах, эр бэлгийн замаар дамжих үед нийлэлтийн тэсвэртэй үеийг өдөөх зорилгоор хувьссан бололтой.3 Өндөгний хөгжил ба нийлэлт нь нөхөн үржихүйн чухал шинж чанар тул эмэгчин Anopheles шумуул эдгээр дааврын дохиог хэрхэн нэгтгэдэгийг ойлгох нь хумхаа өвчний эсрэг шинэ хөтөлбөрүүдийг боловсруулахад дөхөм болно. Энд бид эдгээр нөхөн үржихүйн үйл ажиллагааг экдистероид идэвхжүүлэгч/идэвхгүй болгох ферментийн нарийн төвөгтэй сүлжээгээр дамжуулан өөр өөр бэлгийн стероидууд зохицуулдаг болохыг харуулж байна. Бид бэлгийн замаар дамжих дараа эмэгчний бэлгийн хүлээн авах чадварыг зогсоож, депосфоржуулалтаар идэвхжүүлснээр эцэг эхийг хамгаалдаг эр бэлгийн эсэд өвөрмөц исэлдсэн экдизон 3-дегидро-20E (3D20E)-ийг тодорхойлсон. 3D20E дамжуулалт нь мөн Plasmodium халдварын үед өндгөн эсийн хөгжлийг хадгалдаг нөхөн үржихүйн генийн экспрессийг өдөөж, халдвар авсан эмэгчний эрүүл мэндийг баталгаажуулдаг. Эмэгчин шумуулаас гаралтай 20E нь... бэлгийн хариу урвал үүсгэдэггүй боловч 20E-дарангуйлагч киназууд дарангуйлагдсаны дараа нийлдэг бодгалиудад өндөглөх боломжийг олгодог. Энэхүү эр хүний ​​өвөрмөц шавьжны стероид дааврыг тодорхойлсон нь болон эмэгчний бэлгийн хүлээн авах чадвар, үржил шим, плазмодиумтай харилцан үйлчлэлийг зохицуулахад гүйцэтгэх үүрэг нь хумхаа өвчнийг дамжуулдаг шумуулын нөхөн үржихүйн амжилтыг бууруулах боломжтойг харуулж байна.
Хүний хумхаа өвчний цорын ганц тээвэрлэгч болох Anopheles шумууланд шавьж устгах бодист тэсвэртэй байдал өргөн тархсан тул хумхаа өвчний тохиолдол, нас баралт дахин нэмэгдэж байна4. Эдгээр шумуулын үржих биологи нь хумхаа өвчний хяналтын шинэ арга хэмжээнд онцгой анхаарал татдаг, учир нь эмэгчин нь зөвхөн нэг удаа үрждэг5; энэхүү ганц үржлийн үйл явдлыг ариутгах нь хээрийн шумуулын тоо толгойг бууруулахад ихээхэн боломжтой юм.
Эмэгтэйчүүд эрчүүдээс өндөр титртэй стероид дааврыг авсны дараа бэлгийн чадваргүй болдог. Судалгаагаар цаашид үржихэд бэрхшээл учруулдаг хүчин зүйл нь авгалдайн үе шатанд хайлах мөчлөгийн зохицуулагч гэгддэг стероид даавр болох 20-гидроксиэкдизон (20E) болохыг харуулсан. Эрчүүдийн 20E-г нэгтгэж, дамжуулах чадвар нь Африкт тархсан бөгөөд Anopheles gambiae зэрэг хумхаа өвчний хамгийн аюултай тээвэрлэгчдийг багтаасан Cellia7 дэд төрөл зүйлийн нэг хэсэг болох Anopheles зүйлд онцгойлон хөгжсөн. Энэ нь ялангуяа анхаарал татахуйц зүйл юм, учир нь эдгээр зүйлд эмэгчин нь цусны хоол бүрийн дараа 20E үүсгэдэг бөгөөд 20E нь оогенезийн мөчлөгийг удирддаг (8-р лавлагааг үзнэ үү). Гэсэн хэдий ч эмэгчин нь экдисоны хоёр өөр эх үүсвэрээс (эрчүүдийн дамжуулалт ба цусаар хооллох өдөөлт) дохиог хэрхэн нэгтгэдэг талаар бага мэдээлэлтэй байдаг бөгөөд энэ нь тэдний үржих чадварыг алдагдуулдаг. Үнэндээ, хэрэв эмэгчинүүдийн үүсгэдэг 20E нь бэлгийн үл тэвчих байдлыг өдөөдөг бол энэ нь онгон хооллодог хүмүүст үргүйдэлд хүргэдэг бөгөөд энэ нь эдгээр шумууланд маш түгээмэл тохиолддог зан үйл юм5.
Боломжит тайлбар нь A. gambiae эр эмэгчин нь өөрчлөгдсөн эр эмэгчинд өвөрмөц экдизоныг дамжуулдаг бөгөөд энэ нь эмэгчний нөхөн үржихүйн замд дохиоллын каскадыг идэвхжүүлж, улмаар үржлийн тогтворгүй байдалд хүргэдэг. Гэсэн хэдий ч сээр нуруутан амьтад эстроген, андроген зэрэг олон стероид даавруудтай байдаг ч (9-р лавлагаанд хянасан) бидний мэдэхийн хэрээр андрогенийн талтай стероидууд шавьжинд тогтоогдоогүй байна.
Бид бэлгийн бойжилтын үеийн A. gambiae-ийн эрэгтэй хүний ​​дагалдах булчирхай (MAG)-д стероидын дааврын нөөцийг тодорхойлохын тулд өөрчлөлт оруулах стероидуудыг хайж эхэлсэн. Өмнө нь хэрэглэж байсан бага өвөрмөц аргаас илүү өндөр үзүүлэлттэй шингэний хроматографийг тандем масс спектрометр (HPLC-MS/MS)-тэй хослуулан ашиглан энэ эдэд экдизон (E) болон 20E илрүүлсэн нь өмнөх үр дүнг баталгаажуулсан. Гэсэн хэдий ч дээжинд исэлдсэн фосфоржуулсан стероидууд давамгайлж байсан бөгөөд энэ нь 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 томъёотой нийцэж байна (Зураг 1). Бусад хэлбэрүүдэд 3-дегидро-20E (3D20E) болон 20E-22-фосфат (20E22P) орно. 3D20E22P-ийн HPLC-MS/MS дохионы эрчим нь дефосфоржуулсан хэлбэр болох 3D20E-ээс хоёр дахин, E болон 20E-ээс гурван дахин өндөр байсан (Зураг 1). Хэдийгээр бусад хэсэгт бие болон нөхөн үржихүйн доод зам (LRT; Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 1a). Бид мөн шинээр хаагдсан (<1 хоногтой) эр, эмэгчинд экдистероид шинжилж, зөвхөн MAG-д 3D20E болон 3D20E22P илрүүлсэн; E, 20E болон 20E22P нь хоёр хүйстэнд байсан (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 1b). Эдгээр өгөгдөл нь A. gambiae насанд хүрсэн эрэгчин нь эмэгчинд нийлэгждэггүй MAG-даа өндөр титртэй өөрчлөх даавар үүсгэдэг болохыг харуулж байна.
MAG болон эмэгчин LRT (тосгуур, үрийн цэврүү, паровариум орно)-г 4 хоногтой (4 хоногтой) онгон эрэгчин болон онгон болон нийлсэн эмэгчин (0.5, 3, 12 морины хүчтэй) эмэгчин ... = 0.0032; 12 цаг vs. 0.5 цаг, P = 0.015). Өгөгдөл нь гурван биологийн давталтаас авсан болно. Сонирхолтой экдизон бүрийн оргил хэсгийг шумуулын тоогоор тооцоолж, хэвийн болгосон. Экдизоныг дараах өнгөөр ​​илэрхийлнэ: E, ногоон; 20E, улбар шар; 20E22P, нил ягаан; 3D20E, цэнхэр; 3D20E22P, ягаан. Оруулга нь y тэнхлэг дээрх масштабыг нэмэгдүүлж, экдизонын түвшинг бага харуулна.
3D20E22P болон 3D20E нь үрчлэлтийн үед дамждаг эсэхийг судлахын тулд бид эмэгчин LRT-үүдийг үрчлэлтийн дараах янз бүрийн цаг үед задлан шинжилсэн. Хэдийгээр онгон амьтдад экдизон илрээгүй ч бид үрчлэлтийн дараахан (үрчлэлтийн дараа 0.5 цаг, морины хүчлийн минут) LRT-д их хэмжээний 3D20E22P ажиглагдсан бөгөөд цаг хугацааны явцад буурч, 3D20E-ийн түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 1). Химийн аргаар нийлэгжүүлсэн 3D20E-г стандарт болгон ашигласнаар бид үрчлэлтийн LRT-д энэ стероид дааврын түвшин 20E-ээс дор хаяж 100 дахин их байгааг тогтоосон (Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 1). Тиймээс 3D20E22P нь үрчлэлтийн үеэр эмэгчин LRT-д дамждаг гол эрэгчин экдизон бөгөөд түүний дефосфоржуулсан хэлбэр болох 3D20E нь үрчлэлтийн дараахан маш их хэмжээгээр элбэг болдог. Энэ нь сүүлийн экдизон нь эмэгчин үрчлэлтийн дараах биологид чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
Шинэ РНХ дарааллын (РНХ-seq) өгөгдлийн багцыг үүсгэсний дараа (Зураг 2a), захиалгаар бүтээсэн биоинформатикийн дамжуулах хоолойг ашиглан бид экдизон киназа (EcK), экдизон оксидаза (EO), 20E-өөрчлөгдсөн фосфатазын генийг кодчилдог экдизоныг хайсан. EPP) нь нөхөн үржихүйн эдэд илэрхийлэгддэг. Бид нэг нэр дэвшигч EPP ген болон хоёр боломжит EcK генийг (EcK1 ба EcK2) тодорхойлсон боловч сайн нэр дэвшигч EO генийг олж чадаагүй. Гамбийн MAG-д EPP-ийн бие даасан генүүд өндөр түвшинд (98.9-р хувь) илэрхийлэгдсэн боловч эмэгтэй LRT-д илэрхийлэгдээгүй (Зураг 2b), энэ нь бидний хүлээлтээс ялгаатай байсан, учир нь 3D20E22P-ийн депосфоржуулалт энэ эмэгтэй эдэд явагдсан. Тиймээс бид эр EPP нь үрчлэлтийн үед шилжиж болно гэж үзэж байна. Үнэндээ бид үрчлэлтийн дараа эмэгтэй уургийг далдлахын тулд in vivo тогтвортой изотопын шошгыг ашигласан бөгөөд энэ фермент нь эмэгтэй тосгуурт MS-ээр тодорхойлогдсон (Зураг 2). 2c болон Нэмэлт Хүснэгт 1). MAG болон хосолсон (гэхдээ онгон биш) эмэгтэй LRT-д EPP байгаа эсэхийг мөн тодорхой эсрэгбие ашиглан баталгаажуулсан (Зураг 2d).
a, EcK, EO, болон EPP-г кодчилдог генийг хүйс бүрийн нөхөн үржихүйн эдээс хайх зориулалттай биоинформатикийн хоолой. Сумны хажууд байгаа тоонууд нь алхам бүрт эрэгтэй, эмэгтэй нэр дэвшигчдийн тоог заана. Энэхүү шинжилгээгээр эрэгтэйчүүдэд илэрхийлэгддэг нэг EPP ген (EPP) болон нэг EcK ген (EcK1), мөн хоёр хүйстэнд илэрхийлэгддэг боловч нэр дэвшигч EO ген гаргадаггүй нэг EcK ген (EcK2)-г тодорхойлсон.b, Онгон (V) болон үржлийн (M) Anopheles gambiae болон Anopheles albicans эдүүдэд нэр дэвшигч генийн илэрхийлэлийг харьцуулсан дулааны зураглал. Spca, үр тогтолт; MAGs, эрэгтэйчүүдэд туслах булчирхай; биеийн бусад хэсгүүд, түүний дотор хөх, далавч, хөл, өөхөн бие, дотор эрхтнүүд болон эмэгтэйчүүдийн өндгөвч зэрэг хүйсийн бусад хэсгүүд, мөн эмэгтэйчүүдийн өндгөвч зэрэг орно. EcK2 нь Гамбийн MAG болон тосгуурт хоёуланд нь өндөр хэмжээгээр илэрхийлэгддэг бол EPP нь зөвхөн MAG.c-д байдаг. Эрэгтэй хүний ​​үрийн шингэний бүлгийн шилжилтийг 3, 12 ба 24 морины хүчээр эмэгчний тосгуурт шилжүүлэх протеомын шинжилгээнд хамгийн их агуулагддаг 67 уураг харуулсан. Эмэгчин амьтдыг бүх уургийг шошголох (ба масклах) зорилгоор 15N агуулсан хоолны дэглэмээр өсгөсөн. Шошгогүй эрчүүдийг шошготой эмэгчин амьтадтай нийлүүлж, эмэгтэй LRT-г протеомын шинжилгээнд зориулж 3, 12 ба 24 морины хүчээр задалсан (үрийн шингэний уургийн бүрэн жагсаалтыг Нэмэлт Хүснэгт 1-ээс үзнэ үү). Эдгээр эд эсийн протеомын шинжилгээгээр онгон эрчүүдийн MAG-д EPP, Eck1 ба EcK2 илэрсэн.d, EPP нь хосолсон эмэгтэйчүүдийн MAG болон LRT-д вестерн блотоор илэрсэн боловч онгон эмэгтэйчүүд эсвэл эрчүүд эсвэл эмэгтэйн бусад хэсэгт илрээгүй. бие. Мембрануудыг антиактин (ачааллын хяналт) болон анти-ЭПП эсрэгбиетэй нэгэн зэрэг шинжилсэн. Бүх эрчүүд онгон байна. Гель эх үүсвэрийн өгөгдлийг Нэмэлт Зураг 1-ээс үзнэ үү. Вестерн блотыг хоёр удаа хийсэн бөгөөд ижил төстэй үр дүн гарсан.
EPP-ийн экдистероид фосфофосфатазын идэвхжилийг MAG-аас тусгаарлагдсан 3D20E22P-тэй HPLC-MS/MS-ээр инкубацийн дараа баталгаажуулсан (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 2a). Цаашилбал, бид РНХ-зуучлалтай интерференц (RNAi)-ээр EPP-ийг чимээгүй болгоход эдгээр эрэгчний нөхөн үржихүйн эдэд фосфатазын идэвхжил огцом буурсан болохыг илрүүлсэн (Зураг 3a), мөн EPP-ээр чимээгүй болгосон эрэгчтэй нийлсэн эмэгчин шувууд генийн хэсэгчилсэн чимээгүйжүүлэлтээс үл хамааран дефосфоржуулсан 3D20E-ийн А хувь мэдэгдэхүйц бага байгааг харуулсан (Зураг 3b). Үүний эсрэгээр бид ижил шумууланд 20E22P/20E харьцаанд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт илрээгүй бөгөөд энэ нь фермент нь 3D20E22P-д өвөрмөц болохыг харуулж магадгүй юм (Зураг 3b).
a, Давхар судалтай EPP РНХ (dsEPP) эсвэл давхар судалтай GFP РНХ (dsGFP) хяналтын бүлэг ашиглан EPP чимээгүйжүүлснээс үүдэлтэй MAG дахь фосфатазын идэвхжил буурсан. Давталт бүрт хорин MAG санг ашигласан (P = 0.0046, хосолсон t-тест, хоёр талт), тусдаа цэгүүдээр төлөөлүүлсэн. b, EPP чимээгүйжүүлсэн эрэгчинтэй нийлсэн эмэгчинд 3 морины хүчтэй үед дефосфоржуулсан 3D20E-ийн эзлэх хувь мэдэгдэхүйц бага байсан (P = 0.0043, хослоогүй t-тест, хоёр талт), харин 20E түвшин өөрчлөгдөөгүй (P = 0.063, хослоогүй). t-тест, хоёр талт). Өгөгдлийг тус бүр 13, 16, 19 эмэгчин гэсэн гурван сангаас дундаж ± сем гэж үзүүлэв.c, EPP-тай чимээгүй эрэгчинтэй нийлүүлсэн эмэгчин нь дахин нийлүүлэлтийн түвшин мэдэгдэхүйц өндөр байсан (P = 0.0002, Фишерийн яг тест, хоёр талт). Эмэгчинг эхлээд нийлүүлэлтийн статусаа баталгаажуулахын тулд нийлүүлэхээс өөр аргагүй болгосон; 2 хоногийн дараа тэд трансген эр бэлгийн эс тээж яваа бусад эр эмүүдтэй холбоо барьж, трансгенийг тоон PCR илрүүлэх замаар дахин үржлийн түвшинг үнэлжээ.d, EPP-ээр чимээгүй болгосон эр эмэгчин шувуудтай үржил шим мэдэгдэхүйц буурсан (P < 0.0001; Манн-Уитнигийн шинжилгээ, хоёр талт) болон өндөгний тоо бага зэрэг буурсан (P = 0.088, Манн-Уитнигийн шинжилгээ, хоёр талт) байсан бол түрс шахах түвшинд нөлөөлөөгүй (P = 0.94, Фишерийн яг шинжилгээ, хоёр талт). Бүх самбарт n нь биологийн хувьд бие даасан шумуулын дээжийн тоог илэрхийлнэ. NS, ач холбогдолгүй.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Дараа нь бид эмэгчинд экдизон дефосфоржуулалт нь үржлийн эсэргүүцлийг өдөөхөд чухал эсэхийг үнэлсэн. EPP-ийн дутагдалтай эрчүүдтэй үржсэн эмэгчин амьтад нэмэлт (трансген) эрчүүдтэй харьцах үед хяналтын эмэгчин амьтдаас (10.4%) хамаагүй өндөр давтамжтай (44.9%) дахин үржсэн нь анхаарал татаж байна (Зураг 3c). Мөн бид үржил шим мэдэгдэхүйц буурсан (Зураг 3d, зүүн талд) болон эдгээр эмэгчин амьтдын өндөглөсөн өндөгний тоо бага зэрэг буурсан (Зураг 3d, дунд талд), харин эмэгчин амьтдын өндөглөсөн хувь (үржлийн улмаас эмэгчинд үүссэн өөр нэг хариу үйлдэл)) өөрчлөгдөөгүй (Зураг 3d, баруун талд). 3D20E22P-ийн ажиглагдсан EPP-ийн өвөрмөц чанарыг харгалзан үзвэл эдгээр үр дүнгээс харахад үржлийн үеэр дамжуулсан EPP-ээр 3D20E-г идэвхжүүлэх нь эмэгчин амьтдын цаашдын үржлийг хүлээн авах чадварыг зогсооход чухал үүрэг гүйцэтгэж болох бөгөөд энэ зан үйлийг өмнө нь 20E-ийн бэлгийн замаар дамжихтай холбон тайлбарладаг байсан. Тиймээс энэхүү эр хүнд өвөрмөц даавар нь эмэгтэй хүний ​​үржил шимд хүчтэй нөлөөлдөг.
Дараа нь бид химийн аргаар нийлэгжүүлсэн 3D20E (Зураг 4a–c) болон худалдаанд байгаа 20E ашиглан бэлгийн бойжсон онгон охидод тарилгын туршилтаар 20E болон 3D20E-ийн идэвхийг харьцуулсан. Бид 3D20E нь хоёр концентрацид эмэгчний хээлтүүлгийн мэдрэмтгий байдлыг унтраахад 20E-ээс хамаагүй илүү үр дүнтэй болохыг ажигласан (Зураг 4d). LRT-д 3D20E-ийн физиологийн түвшний тал хувь нь (тариулсны дараа 1,066 pg vs. хээлтүүлсний дараа 2,022 pg) хамгийн өндөр концентрацитай буюу 18 pg хээлтүүлгийн дараа тарилга хийснээс хойш 24 цагийн дараа 20E-ийн физиологийн түвшингээс (тариулсны дараа 361 pg) 20 дахин өндөр тэсвэртэй эмэгчин амьтдын эзлэх хувийг өдөөсөн нь; Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 1). Энэ үр дүн нь 20E-ийн бэлгийн замаар дамжих нь үржлийн тэсвэрлэх хугацааг үүсгэдэггүй гэсэн ойлголттой нийцэж байгаа бөгөөд 3D20E нь эцэг эх, хүүхдийн харилцааг хангах гол хүчин зүйл болохыг харуулж байна. 3D20E нь онгон эмэгчинд өндөглөлтийн шинжилгээнд 20E-ээс хамаагүй илүү идэвхтэй байсан (Зураг 4e), энэ нь EPP-ийг хэсэгчлэн чимээгүй болгосны дараа бидний ажигласан өндөглөлтийн хэвийн хурд нь үржлийн улмаас үүссэн эмэгчин хүчин зүйлсээс үүссэн үлдэгдэл 3D20E идэвхжилтэй холбоотой болохыг харуулж байна.
(a,b) 20E-ээс химийн аргаар 3D20E нийлэгжүүлсэн (a) маш өндөр хувиргалт/үр ашигтай (өгөгдлийг гурван бие даасан синтезийн урвалын дундаж ± сем гэж үзүүлсэн) (b).c, Массын спектр (доод тал) нь хосолсон эмэгчин LRT-д (дээд тал) олдсон экдизонтой яг таарч байна.d, 20E (0.63 мкг, P = 0.02; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишерийн яг тест, хоёр талт) болон 10% этанол (0.63 мкг, P < 0.0001; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишерийн яг тест, 2 талт)-тай харьцуулахад 20E нь зөвхөн өндөр тунгаар (0.63 мкг, P = 0.0002; 0.21 мкг, P = 0.54; Фишерийн яг тест, 2 талт) хяналтын бүлгийнхээс мэдэгдэхүйц өндөр байсан. 3D20E тарилга нь онгон эмэгчинд 10% этанолын хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад түрс шахах түвшинг мэдэгдэхүйц өндөр болгосон (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Фишерийн нарийн шинжилгээ, хоёр талт), харин хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад 20E нь зөвхөн өндөр тунгаар (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Фишерийн нарийн шинжилгээ, хоёр талт) үржүүлсэн. 3D20E нь өндөр тунгаар (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Фишерийн нарийн шинжилгээ, хоёр талт) үрс шахах түвшинг мэдэгдэхүйц өндөр болгосон. Бүх самбарт n нь биологийн хувьд бие даасан шумуулын дээжийн тоог илэрхийлнэ. NS нь ач холбогдолгүй.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Өгөгдөл нь гурван давталтаас гаралтай.
Өмнөх судалгаануудад бид стероидын дааврын бэлгийн замаар дамжих нь эмэгтэйчүүдийг P. falciparum халдвараас хамгаалдаг A. gambiae-ийн үржлийн ген болох MISO (Оогенезийн үржлийн өдөөгч 11)-ийн илэрхийлэлийг өдөөдөг болохыг тогтоосон бөгөөд энэ нь хамгийн үхлийн аюултай хүний ​​хумхаа өвчний шимэгч болох 13-аас үүдэлтэй эрүүл мэндийн зардал юм. Хумхаа өвчний тархалт ихтэй бүс нутагт Анофелсийн нөхөн үржихүйн эрүүл мэндэд MISO-ийн ач холбогдлыг харгалзан бид энэ генийн илэрхийлэлийг 3D20E эсвэл 20E аль даавар өдөөж байгааг тодорхойлохоор шийдсэн. 20E тарилга нь HR3 ба HR4 зэрэг зарим цөмийн дааврын рецепторууд (HR) болон Vg14, 15, 16 зэрэг стероидын ердийн зорилтуудыг тусгайлан эсвэл илүү хүчтэй өдөөдөг боловч MISO нь 3D20E-ээр илүү хүчтэй өдөөгддөг болохыг бид тогтоосон (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 3). Тиймээс энэхүү андрогенийн стероидын дааврын бэлгийн замаар дамжих нь эмэгтэйчүүдийг шимэгчийн халдвараас үүдэлтэй зардлаас хамгаалах механизмыг өдөөдөг бололтой. Цаашилбал, 3D20E нь хоёр изоформд харилцан адилгүй нөлөөлдөг. E рецептор EcR-ийн EcR-ийг өдөөж, EcR-B-г дарангуйлж, эмэгтэй хүний ​​үржилд нөлөөлдөг HPX15 зэрэг бусад үржил шимийг өдөөдөг генийг илүү хүчтэй өдөөдөг. Энэ нь EPP-тай чимээгүй эрчүүдтэй үржилд орсон эмэгтэйчүүдэд ажиглагдсан мэдэгдэхүйц үргүйдлийг тайлбарлаж болох юм (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 3). Эдгээр өгөгдөл нь хүйсийн онцлог үйл ажиллагааны үндэс суурь болж болох хоёр экдизон дааврын идэвхжүүлсэн доод урсгалын замууд байгааг харуулж байна.
Дараа нь бид биоинформатикийн дамжуулах хоолойдоо тодорхойлсон хоёр EcK генийн үйл ажиллагааг туршсан. EcK1 эсвэл EcK2-г чимээгүй болгосноор эрчүүдэд нас баралт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 4a), энэ нь экдизон фосфоржилт, улмаар идэвхгүйжүүлэлт нь амьд үлдэхэд чухал ач холбогдолтой болохыг харуулж байна. EcK2 нь EcK1-ээс өндөр түвшинд илэрхийлэгдэж, MAG-д протеомикоор илэрсэн тул (Зураг 2b,c болон Нэмэлт Хүснэгт 2) бид түүний экдистероид киназын идэвхийг 20E-тэй инкубаци хийж баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь 20E22P фосфоржилт үүсгэсэн (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 2).4b). 3D20E-г субстрат болгон ашиглах үед бид фосфоржуулсан бүтээгдэхүүн 3D20E22P-ийг илрүүлж чадаагүй (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 4c), энэ нь 3D20E-ийн оронд 20E нь EcK2-ийн илүүд үздэг бай байж болохыг харуулж байна.
Бидний РНХ-sequence шинжилгээний дагуу EcK2 нь онгон эмэгчинүүдийн LRT-д өндөр хэмжээгээр илэрхийлэгдсэн бөгөөд нийлсний дараа унтраасан (Зураг 2b). Бид эдгээр өгөгдлийг баталгаажуулж, EcK2-ийн илэрхийлэлд цусаар хооллох нөлөөлөөгүй болохыг тогтоосон (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5a). Анхны MS туршилтаа өргөжүүлснээр бид 20E22P-ийн оргил нь 20E-ийн оргилтой нягт холбоотой болохыг тогтоосон (цусны хоол идсэнээс хойш 22-26 цагийн дараа; Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5b). Онгон эмэгчинд EcK2-ийг чимээгүй болгосноор цусан хоол идсэнээс хойш 26 цагийн дараа 20E ба 20E22P-ийн харьцангуй харьцаа 3 дахин нэмэгдсэн (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 2c ба 5c), энэ нь EcK2 нь эмэгчинд 20E-г фосфоржуулдаг болохыг баталж байна. EcK2-ийн дутагдалтай онгон эмэгчин эмэгтэйчүүд бэлгийн дур хүслийг бүрэн хадгалсан (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5d, e) нь эмэгчинд 20E-ийн үйлдвэрлэл нь нийлбэрийг өдөөдөггүй болохыг харуулж байна. галд тэсвэртэй үеүүд. Гэсэн хэдий ч эдгээр эмэгчин шувууд хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад өндөглөх түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн бөгөөд онгон шувуудын 30 гаруй хувь нь өндөглөдөг байв (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5f). Хэрэв давхар судалтай Eck2 РНХ (dsEcK2) тарилгыг цусаар хооллосны дараа хийсэн бол түрс шахах үйл явц явагдаагүй бөгөөд энэ үед цус залгиснаас үүдэлтэй 20E оргил буурсан байна. Ерөнхийдөө эдгээр үр дүнгүүд нь цус сорсны дараа үүссэн 20E нь түрс шахах үйл явцыг өдөөж болох боловч зөвхөн үрс шахах үйл явцыг (EcK2 болон бусад хүчин зүйлүүд) унтраасан тохиолдолд л үржлийн үйл явцыг зогсоодог гэсэн загварыг дэмжиж байна. 20E болон 3D20E тарилга нь онгон шувуудад EcK2-ийн илэрхийлэлийг дарангуйлаагүй (Өргөтгөсөн мэдээлэл Зураг 5g), энэ нь бусад хүчин зүйлс энэ киназын дарангуйллыг зуучилдаг болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч цусаар хооллосны дараах 20E түвшин нь үржлийн таагүй байдлыг үүсгэхэд хангалтгүй байсан ч бэлгийн замаар дамждаг 3D20E-ийн өндөр титрээр үр дүнтэй өдөөгдсөн.
Бидний үр дүн нь A. gambiae-ийн нөхөн үржихүйн амжилтыг зохицуулах механизмын талаар чухал ойлголтуудыг өгдөг. Эрэгтэйчүүд эмэгчин амьтдыг цаашид үржих мэдрэмжийг бууруулснаар эцэг эхийн гарал үүслийг баталгаажуулдаг эр хүнд өвөрмөц өөрчлөгдсөн экдизон болох 3D20E-ийн өндөр титрийг нийлэгжүүлэхээр хувьсан өөрчлөгдсөн загвар гарч ирсэн. Үүний зэрэгцээ эдгээр хумхаа өвчний векторууд нь эр хүнд өвөрмөц EPP-ийн бэлгийн замаар дамжих хариуд эмэгчинд 3D20E-ийг идэвхжүүлэх үр дүнтэй системийг боловсруулсан. Бидний мэдэхийн энэ нь шавьжинд өвөрмөц бөгөөд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг эр, эмэгчин давамгайлсан стероид дааврын системийн анхны жишээ юм. Эр хүнд өвөрмөц экдисоны үйл ажиллагааг таамагласан боловч эцсийн байдлаар нотлоогүй байна. Жишээлбэл, эдгээр үүргийг 20E урьдал E1 гүйцэтгэж болно гэсэн таамаглал 18 нь ихээхэн няцаагдсан. Дрозофилад моандри нь тодорхой бэлгийн пептидийн рецептороор дамжуулан эмэгчний нөхөн үржихүйн замыг мэдрүүлдэг мэдрэлийн эсүүдтэй харилцан үйлчилдэг жижиг бэлгийн пептидүүдийн19,20 бэлгийн замаар дамжих замаар өдөөгддөг нь сайн мэдэгдэж байна21,22. Тодорхойлохын тулд цаашид хийх ажил шаардлагатай байна A. gambiae эмэгчинд 3D20E-ээр хянагддаг доод урсгалын дохиоллын каскадууд болон эдгээр каскадууд шумуул болон Дрозофилагийн хооронд хадгалагдаж болох эсэхийг тодорхойлох.
Манай судалгаанд тодорхойлсон 3D20E нь эмэгчний үржил шим, зан төлөвт чухал үүрэг гүйцэтгэдэг тул 3D20E-ийн нийлэгжилт болон идэвхжүүлэлтэд хүргэдэг замууд нь ариутгасан шавьжны технологийн стратегид өрсөлдөх чадвартай ариутгасан эрэгчинг бий болгох гэх мэт ирээдүйн шумуулын хяналтын стратегид шинэ боломжуудыг санал болгож байна. Зэрлэгээр суллах эсвэл онгон тоглоомд 3D20E-г дуурайлган ашиглах. 3D20E-ийн эрэгчинд зориулсан өвөрмөц функц нь A. gambiae болон бусад Cellia зүйлүүд үрийн шингэнээ үржлийн бөглөө болгон бүлэглэх чадварыг олж авснаар хөгжсөн байж магадгүй юм, учир нь энэ нь олон тооны даавар болон даавар идэвхжүүлэгч ферментийг үр дүнтэй дамжуулах боломжийг олгодог. Үүний үр дүнд монандриг хэрэгжүүлсэн 3D20E хувьсал нь эмэгчинд (MISO-ийн өндөр илэрхийлэлээр дамжуулан) хумхаа өвчний тархалт өндөртэй бүс нутагт нөхөн үржихүйн чадвараа дэмжих механизмыг бий болгодог бөгөөд энэ нь шууд бусаар Плазмодиумын халдварт нөлөөлдөг. Эмэгчин 20E нь эмэгчин Anopheles шумууланд P. falciparum-ийн амьдрах чадвар, өсөлтөд гүнзгий нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулсан тул24 эр, эмэгчин стероидын дааврын замууд нь одоо шумуул-шимэгчийн харилцан үйлчлэлийн гол талууд болж байна.
A. gambiae G3 омгийг шавьжны стандарт нөхцөлд (26-28 °C, 65-80% харьцангуй чийгшил, 12:12 цаг гэрэл/харанхуй фотопериод) өсгөсөн. Авгалдайг нунтаг загасны хоолоор (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets болон Tetra Pond Sticks) 7:7:2 харьцаатайгаар тэжээсэн. Насанд хүрсэн шумуулыг 10% декстрозын уусмал болон долоо хоног бүр хүний ​​цусаар (цусны бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг судалсан) тэжээсэн. Онгон шумуулыг микроскопоор үзүүрийг нь шалгасны дараа хүүхэлдэй үе шатанд нь хүйсийг нь ялгаж авсан. DsRed трансген тээгч эрэгчдийг өмнө нь тайлбарласан.
Албадан үржүүлгийн туршилтыг өмнө нь тайлбарласан протоколын дагуу хийсэн. Байгалийн үржүүлгийн хувьд 4 хоногтой онгон эмэгчингүүдийг бэлгийн бойжсон онгон эр эмэгчинтэй 1:3 харьцаатай хоёр шөнө байлгасан. Эрэгчинүүдэд dsEPP тарьсан туршилтын хувьд фосфатазын идэвхжил хамгийн их хэмжээгээр намжсан тарилгын дараах 3-4 дэх өдрүүдтэй хамт торонд оруулах нь давхцаж байсан (Өргөтгөсөн өгөгдөл Зураг 2b).
Шумуулны эд, үлдсэн цогцос (биеийн үлдсэн хэсэг), эсвэл бүхэл биеийг 100% метанол болгон задалж, бөмбөлөг ашиглан нэгэн төрлийн болгосон (2 мм шилэн бөмбөлөг, 2400 эрг/мин, 90 сек). Эдийн хэмжээ болон метанолын хэмжээ дараах байдалтай байв: биеийн үлдсэн хэсэг, 1000 мкл-д 50; MAG, 50–100 80 мкл; эм LRT, 25–50 80 мкл. Тунадасыг ижил хэмжээний метанолоор хоёр дахь метанолоор хандалсан. Эсийн үлдэгдлийг центрифугээр зайлуулсан. Хоёр хандаас гарсан метанолыг нэгтгэж, азотын урсгалын дор хатааж, дараа нь дараах хэмжээний 80% метанолыг усанд дахин уусгасан: биеийн үлдсэн хэсэг, 50 мкл; MAG болон эм LRT, 30 мкл.
Дээжийг LC багаж (Vanquish, Thermo Fisher)-тай холбогдсон масс спектрометр (ID-X, Thermo Fisher) дээр шинжилсэн. 5 мкл дээжийг 25 °C-д хадгалсан 3 мкм, 100 × 4.6 мм хэмжээтэй багана (Inspire C8, Dikma) дээр тарьсан. LC-ийн хөдөлгөөнт фазууд нь A (ус, 0.1% шоргоолжны хүчил) ба B (ацетонитрил, 0.1% шоргоолжны хүчил) байв. LC градиент нь дараах байдалтай байв: 1 минутын турш 5% B, дараа нь 11 минутын турш 100% B хүртэл нэмэгдсэн. 100% дээр 8 минутын дараа баганыг 5% B дээр 4 минутын турш дахин тэнцвэржүүлнэ. Урсгалын хурд 0.3 мл мин-1 байв. MS эх үүсвэрт ионжуулалтыг эерэг ба сөрөг горимд халаасан электрошүршигч ионжуулалтаар гүйцэтгэдэг.
Массын спектрометр нь m/z мужид өгөгдлийг 350-680 хооронд 60,000 нягтралтайгаар бүрэн MS горимд хэмждэг. MS/MS өгөгдлийг [M + H]+ (бүх бай), [M - H2O + H]+ (бүх бай) болон [M - H]- (фосфоржуулсан бай) дээр цуглуулсан. MS/MS өгөгдлийг стандарт байхгүй байнуудын экдисоны шинж чанарыг баталгаажуулахын тулд ашигласан. Байнгын бус экдистероидуудыг тодорхойлохын тулд >15% харьцангуй элбэгшилтэй бүх HPLC оргилуудын MS/MS өгөгдлийг шинжилсэн. Нэг тодорхой дээжийн (бусад бүх бай) үнэмлэхүй хэмжээ эсвэл шингэрүүлэлтийг тооцоолохын тулд цэвэр стандартаас (20E, 3D20E) үүсгэсэн стандарт муруйг ашиглан тоон үзүүлэлтийг тодорхойлж, тэдгээрийн нэг эрд олдсон хэмжээтэй тэнцүү байдлыг тооцоолно. 3D20E-ийн хувьд дараах нэмэлтүүдийн нийлбэрийг ашиглан тоон үзүүлэлтийг хийсэн: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Өгөгдлийг Tracefinder (хувилбар 4.1) ашиглан гаргаж авч, тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. MS/MS өгөгдлийг Xcalibur (хувилбар 4.4) ашиглан шинжилсэн. E, 20E болон 3D20E-ийн MS спектрүүдийг тус тусын стандартуудтай харьцуулсан. 3D20E22P-ийг Жирардын урвалжаар деривативжуулах замаар шинжилсэн. 20E22P-ийг m/z харьцаагаар шинжилсэн.
3D20E22P-г MAG-аас цэвэршүүлсэн. Цэвэршүүлэлтийг HPLC-MS/MS шинжилгээтэй ижил LC нөхцөлд квадрупол масс дээр суурилсан детектор (QDa, Acquity, Waters) бүхий хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматограф (Acquity, Waters) ашиглан аналитик хэмжүүрээр гүйцэтгэсэн. 3D20E22P-тэй харгалзах m/z нь өмнө нь тодорхойлсонтой ижил хадгалах хугацаанд илэрсэн үед фракц цуглуулах ажиллагааг идэвхжүүлсэн. Дараа нь гаргаж авсан нэгдлүүдийн цэвэр байдлыг дээр дурдсанчлан HPLC-MS/MS-ээр шалгасан.
Нийт РНХ-г үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу TRI урвалж (Thermo Fisher) ашиглан 10-12 нөхөн үржихүйн эд эсвэл биеийн бусад хэсгээс (толгойгүй) гаргаж авсан. РНХ-г TURBO DNase (Thermo Fisher)-ээр боловсруулсан. cDNA-г үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Moloney хулганы лейкемийн вирусын урвуу транскриптаза (M-MLV RT; Thermo Fisher) ашиглан нийлэгжүүлсэн. Урвуу транскрипцийн тоон PCR (RT-qPCR; Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 2)-ийн праймеруудыг өмнө нь нийтэлсэн24 эсвэл Primer-BLAST26 ашиглан бүтээсэн бөгөөд 70-150 bp хэмжээтэй, экзон-экзон уулзвар эсвэл Primer хос праймеруудыг тусад нь экзон болгон хуваасан бүтээгдэхүүнүүдэд давуу эрх олгосон. Гурваас дөрвөн биологийн давталтын cDNA дээжийг RT-qPCR-д зориулж усанд дөрөв дахин шингэлсэн. Тоон үзүүлэлтийг 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймер, 5 µl шингэрүүлсэн cDNA агуулсан 15 µl давталтын урвалаар гүйцэтгэсэн. Урвалуудыг QuantStudio 6 Pro бодит цагийн PCR систем (Thermo Fisher) болон өгөгдлийг цуглуулж, Design and Analysis (хувилбар 2.4.3) ашиглан шинжилсэн. Энэхүү судалгаанд харуулсанчлан, харьцангуй хэмжээг рибосомын RpL19 ген (AGAP004422)-д хэвийн болгосон бөгөөд түүний илэрхийлэл нь цусаар хооллох 27 эсвэл хослох 3-тай мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй.
РНХ-ийн чанарыг Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) ашиглан шалгасан. Illumina хос төгсгөлтэй сангуудыг MIT-ийн Броад хүрээлэн болон Харвардын их сургуульд бэлтгэж ажиллуулсан. Дарааллын уншилтыг анхдагч параметрүүдтэй HISAT2 (хувилбар 2.0.5) ашиглан A. gambiae геном (PEST омог, хувилбар 4.12)-тай уялдуулсан. Зураглалын чанар (MAPQ) оноо <30-тай уншилтыг Samtools (хувилбар 1.3.1) ашиглан арилгасан. Гентэй зураглагдсан уншилтын тоог анхдагч параметрүүдтэй htseq-count (хувилбар 0.9.1) ашиглан тоолсон. Хэвийн болгосон уншилтын тоог тооцоолж, дифференциал генийн экспрессийг R (хувилбар 4.0.3) дахь DESeq2 багц (хувилбар 1.28.1) ашиглан шинжилсэн.
Экдисоныг өөрчилдөг генийн нэр дэвшигчдийг эхлээд PSI-BLAST алгоритм (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) ашиглан A. gambiae геномыг анхдагч утгуудаар хайж тодорхойлсон. Дараах асуулгын уургийн дараалалтай параметрүүд: Bombyx mori (Нэвтрэх дугаар NP_001038956.1), Musca domestica (Нэвтрэх дугаар XP_005182020.1, XP_005175332.1 ба XP_011294434.1) болон Microplitis demolitor (Нэвтрэх дугаар XP_008552646.1 ба XP_008552645.1)-аас авсан EcK, B. mori (Нэвтрэх дугаар NP_001036900), Drosophila melanogaster (Нэвтрэх дугаар NP_651202)-аас авсан EcK, Apis mellifera (Холбоос № XP_394838) болон Acyrthosiphon pisum (Холбоос № XP_001947166); мөн B. mori-ээс авсан EPP (Холбоос № XP_001947166) NP_001177919.1 болон NP_001243996.1) болон D. melanogaster-ийн EO (Холбоос № NP_572986.1) (1-р алхам). Дараа нь Гамби улсад нөхөн үржихүйн эдэд (эмэгтэй LRT эсвэл MAG) өндөр mRNA илэрхийлэл (сая газрын зурагтай уншилтад >100 фрагмент/килобаз экзон (FPKM) эсвэл >85%) үндэслэн шүүлтүүрийн цохилтыг хийнэ (2-р алхам). Өвөрмөц чанарыг сайжруулахын тулд бид үржлийн үед экдизоныг нэгтгэдэггүй эсвэл дамжуулдаггүй анофелес зүйл болох A. albimanus-ийн нөхөн үржихүйн эдэд илэрхийлэгддэг нэр дэвшигч ферментүүдийг сонгосон. Нэр дэвшигч генийг A. albimanus-ийн нөхөн үржихүйн эдэд бага илэрхийлэл (<100 FPKM эсвэл <85-р перцентиль) дээр үндэслэн шүүсэн (3-р алхам). Эцсийн шүүлтүүрийн хувьд (4-р алхам) нэр дэвшигч генүүд нь дараахь зүйлсийн дор хаяж нэгийг хангах шаардлагатай: (1) ялгаварлан илэрхийлэгдсэн генийн шинжилгээний дагуу үржлийн дараа мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (P < 0.05) болон (2) нөхөн үржихүйн бус эдэд (< 85 % эсвэл <100 FPKM).
Бид бүхэл бүтэн организмын изотопын шошгололтод хүрэхийн тулд өмнө нь тайлбарласан 28,29,30 аргуудыг өөрчилсөн. Товчхондоо, зэрлэг Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma)-ийг (жин/эзэлхүүн) 2% глюкоз (G7528, Sigma), 1.7% амин хүчилгүй, аммонийн сульфат агуулсан мөөгөнцрийн азотын суурь (BD Difco, DF0335) болон азотын цорын ганц эх үүсвэр болох 5% 15N аммонийн сульфат (NLM-713, >99%, Кембрижийн изотопын лаборатори)-д туршсан. Мөөгөнцрийг центрифугээр ялгаж авсан бөгөөд шумуулын авгалдайг гөлөг болтол нь дур мэдэн тэжээсэн. Дөрөв дэх насандаа үхэхээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд загасны гурилаар (300 авгалдай тутамд 0.5 мг) нэмэлт тэжээл өгсөн. Дараа нь зөвхөн эмэгчин амьтдыг шошгогүй эрэгчин амьтадтай үржлийн туршилтанд ашигласан бөгөөд үржлийн үеэр шилжүүлсэн эрэгчин протеомыг шинжлэхэд ашигласан.
4-6 хоногтой, 15N шошготой онгон эмэгчингүүдийг нас нь тохирсон, шошгогүй онгон эрэгчинтэй нийлүүлэхээс өөр аргагүй болгосон. Амжилттай нийлүүлэлтийг эпифлуоресценцийн микроскопоор нийлүүлэлтийн бөглөөг илрүүлснээр баталгаажуулсан. 3, 12, 24 морины хурдтай үед 45-55 нийлүүлсэн эмэгчний тосгуурыг 50 мкл аммонийн бикарбонатын буфер (рН 7.8) болгон задалж, пестлээр нэгэн төрлийн болгосон. Гомогенатыг центрифугээр түлхэж, дээд давхаргыг 50 мМ аммонийн бикарбонат дахь 50 мкл 0.1% RapiGest (186001860, Уотерс)-тай хольсон. Дээж тус бүрийн дээд давхарга болон үрлийг хуурай мөсөн дээр хөлдөөж, Вашингтоны Их Сургуулийн МакКосс лабораторид шөнийн турш илгээсэн бөгөөд тэнд LC-MS/MS-ийн дээжийг бэлтгэсэн. Үрлийг 50 мМ аммонийн 0.1% RapiGest-ийн 50 мкл-д дахин уусгана. Усан ваннд бикарбонат ба хэт авиан шинжилгээ хийнэ. Үрлэн болон дээд давхаргын уургийн концентрацийг BCA шинжилгээгээр хэмжиж, дээжийг 5 мМ дитиотреитол (DTT; Sigma)-аар бууруулж, 15 мМ иодоацетамид (Sigma)-аар алкилжуулж, 37 °C (1:0 50)-д 1 цагийн турш трипсинжилт: трипсин: субстратын харьцаагаар инкубацлав. RapiGest-ийг 200 мМ HCl нэмж лизисжүүлж, дараа нь 37 °C-д 45 минут инкубацлаж, 4 °C-д 10 минутын турш 14,000 эрг/мин-д центрифугээр хог хаягдлыг зайлуулав. Дээжийг хос горимтой хатуу фазын хандлах аргаар (Oasis MCX cartridges, Waters) угааж, 0.1% шоргоолжны хүчилд дахин уусгаж, эцсийн уургийн концентраци 0.33 мкг мкл-1 болсон. Шошгогүй MAG протеомуудыг онгоноос нь ижил төстэй байдлаар шинжилсэн. эрчүүд. Дээж тус бүрт хоёр аналитик давталтыг шинжилсэн. Дараа нь тус бүрээс 1 мкг-ийг 25 см-ийн хайлуулсан цахиурын 75 мкм багана, Jupiter C12 урвуу фазын давирхай (Phenomenex)-аар дүүргэсэн 4 см-ийн хайлуулсан цахиурын Kasil1 (PQ) фрит хавх болон 180 минутын шингэн хроматограф ашиглан шинжилсэн. Дээжийн дайжест – MS/MS-ийг nanoACQUITY UPLC систем (Waters) бүхий Q-Exactive HF масс спектрометр (Thermo Fisher) дээр ажиллуулсан. Ажиллагаа бүрт үүссэн өгөгдөлтэй холбоотой олж авах өгөгдлийг Proteowizard (3.0.20287 хувилбар) болон Comet31 (3.2 хувилбар) ашиглан Anopheles gambiae (VectorBase хувилбар 54), Anopheles coluzzi-ийн уургийн дарааллыг агуулсан FASTA мэдээллийн сантай харьцуулан mzML формат руу хөрвүүлсэн. Mali-NIH (VectorBase хувилбар 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021 оны 3-р сар), A. gambiae RNA-seq болон мэдэгдэж буй хүний ​​бохирдуулагчдын гурван хүрээний орчуулга дээр хайлт хийсэн. Пептидийн зурагтай таарсан FDR-ийг Percolator32 (3.05 хувилбар) ашиглан 0.01 босготой тодорхойлж, пептидийг Limelight33 дахь уургийн парсимонийг ашиглан уургийн тодорхойлолт болгон угсарсан. (2.2.0 хувилбар). Харьцангуй уургийн элбэгшлийг өмнө нь тайлбарласны дагуу гүйлт бүрт уураг тус бүрт тооцоолсон хэвийн болгосон спектрийн элбэгшлийн коэффициент (NSAF) ашиглан тооцоолсон. Уураг тус бүрт харьцуулсан NSAF-ийг хоёр өөр биологийн давталтаас авсан дээжүүдийн дунджаар тооцоолсон. 15N шошгололт нь эмэгчин протеомыг амжилттай далдалсан боловч шошготой онгонуудаас бага хэмжээний шошгогүй уураг илрүүлж чадсан. Бид эмэгчин түүхий дээжинд эр уургийн бууралт (1-5 спектр)-ийг зөвхөн техникийн гүйлтээр илрүүлсэн бөгөөд түүхий дээжийг эр/холбогдсон дээжийн дараа HPLC "шилжүүлэлтийн" үр дүнд хийсэн. Шошготой онгонуудаас "бохирдуулагч" гэж илэрсэн хааяа тохиолддог уургуудыг Нэмэлт Хүснэгт 1-д жагсаасан болно.
Genscript-д QTTDRVAPAPDQQQ (PA изотипийн дотор) болон MESDGTTPSGDSEQ (PA ба PB изотипийн дотор) гэсэн хоёр эсрэгтөрөгчийн пептидийг ашигласан. Хоёр пептидийг нэгтгэж, дараа нь KLH тээвэрлэгч уурагтай холбож, Шинэ Зеландын туулайнд тарьсан. Туулайг дөрөв дэх тарилгын дараа нядалгаанд оруулж, нийт IgG-ийг аффинит цэвэршүүлэлтээр ялгаж авсан. EPP-д хамгийн их хамааралтай туулайнаас авсан IgG-ийг цаашид вестерн блоттинг хийхэд ашигласан.
Вестерн блотын хувьд MAG (n = 10, энд n нь биологийн хувьд бие даасан шумуулын дээжийн тоог илэрхийлнэ) болон эмэгчин LRT (n = 30)-ийг 4 хоногтой онгон эрэгчин болон онгон эсвэл хүчээр нийлүүлсэн эмэгчин шувуудаас (<10 нийлүүлсний дараа) тусад нь нэмсэн. Уургийн гарган авах буфер (50 мМ Трис, рН 8.0; 1% NP-40; 0.25% натрийн дезоксихолат; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× протеазын дарангуйлагч коктейль (Roche))-ийг тусад нь нэмсэн. Дээжийг шилэн бөмбөлөг (2 мм шилэн бөмбөлөг, 2400 эрг/мин, 90 сек) ашиглан задалсны дараа шууд нэгэн төрлийн болгосон. Уусдаггүй хог хаягдлыг 20,000 г-д 4°C-т центрифугээр зайлуулсан. Уургийг Брэдфордын шинжилгээгээр (Bio-Rad) тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Дараа нь 20 мкг MAG уураг, 40 мкг LRT уураг, 20 мкг Үлдэгдэл их хэмжээний уургийг денатурацид оруулж, MOPS буфер ашиглан 10% Bis-Tris NuPAGE-ээр ялгасан. Уургуудыг iBlot2 дамжуулах систем (Thermo Fisher) ашиглан поливинилиден фторидын мембран руу шилжүүлсэн. Мембрануудыг 1× PBS-T-д хоёр удаа (PBS-д 0.1% Tween-20) угааж, дараа нь Odyssey хаах буферт (Li-Cor) 22°C-д 1 цагийн турш хаасан. Мембрануудыг 4°C-д захиалгат туулайн эсрэг EPP поликлонал анхдагч эсрэгбие (хаах буферт 1:700) болон хархны эсрэг актин моноклонал анхдагч эсрэгбие MAC237 (Abeam; 1:4,000)-аар шөнөжин сэгсэрсэн. Мембрануудыг PBS-T-ээр угааж, дараа нь 0.01% SDS агуулсан хаах буферт хоёрдогч эсрэгбие (илжигний эсрэг туулай 800CW болон ямааны эсрэг харх 680LT (Li-Cor), хоёулаа 1:20,000)-аар инкубацалсан. 0.2% Tween -20 уусмалыг 22 °C-д 1 цагийн турш байлгана. Мембрануудыг PBS-T-ээр угааж, Odyssey CLx сканнераар дүрсэлсэн. Зургийг Image Studio (5.2 хувилбар)-д цуглуулж боловсруулсан. EPP-RA изоформд (82 kDa) харгалзах тодорхой зурвас илрээгүй.
EPP-ийн кодчилдог бүсүүд (гистидин фосфатазын домэйн агуулсан AGAP002463-RB изоформ, NCBI хадгалсан домэйн хайлт 34) болон EcK2 (AGAP002181)-ийг pET-21a(+) плазмид (Novagen Millipore Sigma) болгон клончилсон; Праймеруудыг Өргөтгөсөн Өгөгдлийн Хүснэгт 2-т жагсаасан болно. pET-21a(+)-EcK2 бүтцийн С-терминал 6xHis шошгоны өмнө найман GS4 холбогчийг (хамтдаа) оруулсан. Рекомбинант уургуудыг NEBExpress эсгүй E. coli уургийн нийлэгжилтийн урвал (New England BioLabs) ашиглан гарган авсан. Рекомбинант уургуудыг NEBExpress Ni спин багана (New England BioLabs) ашиглан цэвэршүүлсэн. Дигидрофолат редуктаза (DHFR) хяналтын уургийг NEBExpress эсгүй E. coli уургийн нийлэгжилтийн иж бүрдлийн ДНХ-ийн загварыг ашиглан гарган авсан. Уургуудыг PBS-д 50% глицеролд -20 °C температурт 3 сар хүртэл хадгалсан.
EPP болон эдийн хандын фосфатазын идэвхийг 4-нитрофенил фосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) ашиглан хэмжсэн. Урвалын буфер нь 25 мМ Трис, 50 ​​мМ цууны хүчил, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA, 1 мМ DTT агуулсан. Эдийг урвалын буферт нэгэн төрлийн болгож, эсийн хог хаягдлыг центрифугээр зайлуулсан. 2.5 мг мл-1 pNPP агуулсан урвалын буферт фермент эсвэл эдийн ханд нэмж урвалыг эхлүүлнэ. Урвалын хольцыг өрөөний температурт харанхуйд инкубацлаж, pNPP-ээс хувиргасан pNP-ийн хэмжээг янз бүрийн үед 405 нм-д шингээлтийг хэмжиж тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон.
In vitro EcK идэвхжилийн хувьд уургийг 10 мМ HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 мМ ATP болон 10 мМ MgCl2 агуулсан 200 мкл буфер (рН 7.5)-д 0.2 мг 20E эсвэл 3D20E-тэй хамт 27°C-т 2 цагийн турш инкубацлав. Урвалыг 800 мкл метанол нэмж зогсоож, дараа нь -20°C-т 1 цагийн турш хөргөж, дараа нь 20,000 г-т 4°C-т 10 минутын турш центрифугээр ялгав. Дараа нь дээд давхаргыг HPLC-MS/MS аргаар шинжилсэн. Хяналтын бүлэгт ашигласан уургуудыг дулаанаар идэвхгүйжүүлэхийн тулд уургуудыг PBS-д 50% глицеролд 95°C-т 20 минутын турш инкубацлав.
In vitro EPP идэвхжилийн хувьд уургийг 25 мМ Трис, 50 ​​мМ цууны хүчил, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0.1 мМ EDTA, 1 мМ DTT агуулсан 100 мкл буферт (рН 7.5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS-ээр цэвэршүүлсэн 18 хос MAG-д агуулагдах хэмжээтэй тэнцүү) 27°C-д 3 цагийн турш инкубацлав. Урвалыг 400 мкл метанол нэмж зогсоож, -20°C-д 1 цагийн турш хөргөөд, дараа нь 20,000 г-д 4°C-д 10 минутын турш центрифугээр шарав. Дээд давхаргыг HPLC-MS/MS-ээр шинжилсэн.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) болон EcK2 (556 bp)-ийн PCR фрагментуудыг холимог хүйсийн толгойгүй шумуулын цогцосноос бэлтгэсэн кДНХ-ээс олшруулсан. eGFP хяналтын (495 bp) PCR фрагментийг өмнө нь тайлбарласан pCR2.1-eGFP-ээс олшруулсан; PCR праймеруудыг Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 2-т жагсаасан болно. PCR фрагментийг pL4440 плазмид дээрх урвуу T7 промоторуудын хооронд оруулсан. Плазмидын бүтцийг NEB 5-α чадвартай E. coli (Шинэ Английн Биолаборатори)-аас гаргаж авч, хэрэглэхийн өмнө ДНХ-ийн дарааллаар баталгаажуулсан (оролтын дарааллыг Нэмэлт өгөгдөл 1-ээс үзнэ үү). T7 промотортой (Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 2) тааруулсан праймеруудыг pL4440 дээр суурилсан плазмидаас оруулсан хэсгийг олшруулахад ашигласан. PCR бүтээгдэхүүний хэмжээг агарозын гель электрофорезоор баталгаажуулсан. dsRNA-г Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ашиглан PCR загваруудаас хуулбарлаж, өмнө нь тайлбарласан өөрчлөлтүүдтэй хамт үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу цэвэршүүлсэн.
dsRNA тарилгын хувьд эклозын дараа 1 хоногийн дотор насанд хүрсэн эрэгтэй эсвэл эмэгтэй (Nanoject III, Drummond)-ийн цээжинд 10 нг nl-1 концентрацитай 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) тарьсан. Генийн нокдаун түвшинг дор хаяж гурван биологийн давталтад РНХ-ийн ялгаруулалт, кДНХ-ийн синтез, RT-qPCR-ээр тодорхойлсон. Экдизон тарилгын хувьд 4 хоногтой онгон эсвэл 6 хоногтой онгон цусаар хооллосон эмэгчинд туршилтын загвараас хамааран 1.3, 2.1 концентрацитай 0.13, 0.21, эсвэл 0.63 мкг 20E эсвэл 3D20E (Nanoject III, Drummond)-ийг тус тус 6.3 нг nl-1 тарьсан. 10%-ийн 100 нл (vol/vol) тарьсан. Усанд агуулагдах этанол; 10% этанолд агуулагдах 100 мл 3D20E22P (MAG хосоос олдсон хэмжээний 75% -тай тэнцүү). Шумуулыг тарилгын бүлэгт санамсаргүй байдлаар хуваарилсан.
Түрс шахах шинжилгээнд 3 хоногтой эмэгчингүүдийг хүний ​​цусаар дур мэдэн хооллосон. Хагас хооллосон эсвэл хооллоогүй шумуулыг зайлуул. Эмчилгээнээс хамааран эмэгчингүүдийг цусан хоол идсэнээс хойш дор хаяж 48 цагийн турш тусдаа түрс шахах аяганд хийж дөрвөн шөнө байлгасан. Өндгийг стереоскопоор (Stemi 508, Zeiss) тоолсон; нийлсэн эмэгчингүүдийн хувьд авгалдай болсон өндөгийг үржил шимтэй гэж үзсэн.
Үржлийн туршилтын хувьд эмэгчин амьтдыг үржлийн эсэргүүцэл үүсэхийн тулд эмчилгээнээс хамааран дор хаяж 2 хоног байлгасан бөгөөд зэрлэг хэлбэрийн насны тохирсон эрэгчнүүдийг дараа нь ижил торонд оруулсан. Хоёр шөнийн дараа эмэгчин үр тогтсон цэврүүг задлан шинжилж, геномын ДНХ-г хөлдөөх-гэсгээх болон хэт авиан шинжилгээгээр 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, 25 мМ NaCl (рН 8.2) агуулсан буферт ялгаруулсан. Дээжийг протеиназа К (0.86 мкг мкл-1)-тэй 55 °C-д 15 минут, дараа нь 95 °C-д 10 минут инкубацалсан. Түүхий геномын ДНХ-ийн бэлдмэлийг 10 дахин шингэлж, Y хромосомын дарааллыг qPCR илрүүлэх шинжилгээнд хамруулсан; праймеруудыг Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 2-т жагсаасан болно. Y хромосомын дараалал байхгүй байгаа нь үржлийн шинж тэмдэггүй байгааг илтгэнэ.
Дахин үржлийн шинжилгээнд хүчээр үржүүлсэн эмэгчин амьтдыг үржлийн байдлыг баталгаажуулахын тулд үржлийн бөглөө байгаа эсэхийг шалгаж, өмнө нь тайлбарласны дагуу 36 эрэгчин байхгүй үед үржлийн эсэргүүцэл үүсэх хүртэл 2 хоног хүлээсэн. Дараа нь DsRed трансген эр бэлгийн эсийг эмэгчин эсийн торонд оруулсан. Хоёр шөнийн дараа үржил шимтэй цэврүүг эмэгчин эсээс салгаж, геномын ДНХ-ийг дээр дурдсанчлан бэлтгэж, DsRed трансгенийг qPCR илрүүлэхэд хамруулсан; праймеруудыг Өргөтгөсөн өгөгдлийн хүснэгт 2-т жагсаасан болно. DsRed трансген байхгүй байгаа нь дахин үржүүлэг болоогүй болохыг харуулж байна.
3D20E-г өмнө нь тайлбарласны дагуу нийлэгжүүлсэн 37. Товчхондоо, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich)-ийг 10 мл усанд уусгаж, дараа нь 30 мг цагаан алтны хар (нунтаг хэлбэрээр, Sigma-Aldrich) нэмсэн. Урвалын холимогт O2-ийн зөөлөн урсгалыг тасралтгүй бөмбөлөг болгон оруулж, өрөөний температурт хутгасан. 6 цагийн дараа урвалыг зогсоохын тулд 30 мл метанол нэмсэн. Катализаторын хэсгүүдийг арилгахын тулд хольцыг центрифугээр түлхсэн. Дээд давхаргыг өрөөний температурт вакуумд хуурай болтол ууршуулсан. Хатаасан урвалын бүтээгдэхүүнийг HPLC-MS/MS шинжилгээнд зориулж тарилгын зорилгоор 10% этанол болон метанолд уусгасан. Хөрвүүлэлтийн хэмжээ (20E-ээс 3D20E хүртэл) ойролцоогоор 97% байсан (Зураг 4b), нийлэгжүүлсэн 3D20E-ийн MS спектр нь хосолсон эмэгчинд байдаг спектртэй тохирч байсан (Зураг 4c).
Домогт хийгдсэн статистикийн туршилтуудын тодорхой мэдээллийг агуулсан болно. Фишерийн нарийн тест, Мантел-Коксын тест, Студений t-тестийг гүйцэтгэхэд GraphPad (9.0 хувилбар)-г ашигласан. Кокран-Мантел-Хензелийн тестийг захиалгат R скрипт ашиглан хийсэн (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test хаягаар авах боломжтой). Өгөгдлийн тархалтыг Шапиро-Вилкийн тестийг ашиглан 0.05 ач холбогдлын босготой хэвийн байдалд туршсан. Өгөгдөл хэвийн байдлын тестэд тэнцээгүй үед Манн-Уитнигийн тестийг хийсэн. Амьд үлдэх өгөгдлийг Мантел-Коксын тестийг ашиглан шинжилсэн. DESeq2 багцыг (1.28.1 хувилбар) РНХ-seq генийн түвшний дифференциал илэрхийллийн шинжилгээ хийхэд ашигласан. График дээрх хэвтээ шугам нь медианыг илэрхийлнэ. Бүх туршилтын босго болгон P = 0.05 ач холбогдлын утгыг ашигласан.
Судалгааны дизайны талаар дэлгэрэнгүй мэдээллийг энэ нийтлэлтэй холбоотой Байгалийн судалгааны тайлангийн товч агуулгыг үзнэ үү.
MS протеомик өгөгдлийг PXD032157 өгөгдлийн багц танигчтай PRIDE түншийн репозитороор (https://www.ebi.ac.uk/pride/) дамжуулан ProteomeXchange консорциумд (http://proteomecentral.proteomexchange.org) хадгалсан.
РНХ-seq өгөгдлийн багцыг GSE198665 цуврал бичлэгийн дор Генийн экспрессийн цогц номын санд (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) хадгалсан.
Одоогийн судалгааны явцад бий болгосон болон/эсвэл шинжилсэн нэмэлт өгөгдлийн багцыг зохих ёсны хүсэлтийн дагуу холбогдох зохиогчдоос авч болно. Энэхүү нийтлэлд эх сурвалжийн өгөгдлийг оруулсан болно.
Де Луф, А. Экдистероидууд: Шавьжны бэлгийн стероидуудыг үл тоомсорлодог уу? Эрэгтэй: Хар хайрцаг. Шавьжны шинжлэх ухаан.13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон ба Anopheles stephens-ийн өндгөвчний хөгжил. J. Шавьжны физиологи.28, 97–109 (1982).