Шүүрлийн зам дахь уургийн ялгарал нь эсийн хуваагдал болон гомеостазыг хадгалахад чухал үүрэгтэй. Бүрхүүлийн зуучлалаар ялгахаас гадна кинезин ялгахад липидийн үүрэг нь шүүрэл дамжуулах процесст хараахан хариулт аваагүй удаан хугацааны үндсэн асуулт юм. Энд бид маш урт керамидын липидийн хэсгүүдтэй шинээр нийлэгжсэн гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизацилагдсан уургууд нь бөөгнөрөлтэй бөгөөд трансмембран уургуудын ашигладаг хэсгээс өөр тусгай эндоплазмын цэвэр гаралтын хэсэгт ангилагддаг болохыг in vivo нотлохын тулд 3D нэгэн зэрэг олон өнгийн өндөр нягтралтай бодит цагийн дүрслэлийг гүйцэтгэдэг. Нэмж дурдахад, бид эндоплазмын торлог бүрхэвч дэх керамидын гинжин хэлхээний урт нь энэхүү ялгах сонгомол байдалд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. Бидний судалгаа нь липидийн гинжин хэлхээний урт дээр үндэслэн уургийн ачааг шүүрэл дамжуулах зам дахь сонгомол экспортын хэсэгт ангилах анхны шууд in vivo нотолгоог өгч байна.
Эукариот эсүүдэд эндоплазмын торлог бүрхэвчинд (ER) нийлэгжсэн уургууд нь зохих эсийн очих газартаа хүргэхийн тулд шүүрлийн замаар тээвэрлэлтийн явцад ялгардаг (1). Бүрхүүлийн зуучлалаар ялгахаас гадна тодорхой липидүүд нь тодорхой уургуудтай ижил мембраны домэйнд бөөгнөрснөөр сонгомол гарах цэг болж чадна гэж удаан хугацаанд таамаглаж байсан (2-5). Гэсэн хэдий ч энэхүү липид дээр суурилсан механизмыг нотлох шууд in vivo нотолгоо дутмаг хэвээр байна. Энэхүү үндсэн асуудлыг шийдэхийн тулд бид мөөгөнцрийн ургамалд гликозилфосфатидилинозитол (GPI) зангуутай уургууд (GPI-APs) ER-ээс хэрхэн ялгаварлан экспортлогддогийг судалсан. GPI-APs нь липидтэй холбогдсон эсийн гадаргуугийн уургуудын төрөл юм (6, 7). GPI-AP нь гликолипид хэсэг (GPI зангуу)-аар дамжуулан плазмын мембраны гаднах навчнуудад бэхлэгдсэн ялгардаг уураг юм. Тэд GPI зангууг ER люменд консерватив дараах трансляцийн өөрчлөлт болгон хүлээн авдаг (8). Хавсарсны дараа GPI-AP нь ER-ээс плазмын мембран руу Гольги аппаратаар дамжин өнгөрдөг (5, 9). GPI зангуу байгаа нь GPI-AP-ийг трансмембранаар ялгардаг уургуудаас (бусад плазмын мембраны уургуудыг оролцуулан) шүүрлийн замын дагуу тусад нь тээвэрлэхэд хүргэдэг (5, 9, 10). Мөөгөнцрийн эсүүдэд GPI-AP-ууд нь эндоплазмын торлог бүрхэвчинд бусад ялгардаг уургуудаас тусгаарлагдаж, дараа нь бүрхүүлийн уургийн цогцолбор II (COPII) -ээр ороосон өвөрмөц цэврүүцэрт савлагддаг (6, 7). ER экспортын процесст энэхүү ангиллын процессын тодорхойлогч хүчин зүйлс тодорхойгүй байгаа ч энэ механизм нь липид, ялангуяа GPI зангууны липидийн хэсгийн бүтцийн өөрчлөлтийг шаарддаг гэж таамаглаж байна (5, 8). Мөөгөнцрийн хувьд GPI липидийн өөрчлөлт нь GPI наалдсаны дараа шууд эхэлдэг бөгөөд олон тохиолдолд керамидыг 26 нүүрстөрөгчийн урт гинжин ханасан тосны хүчилд (C26:0) холбоход хүргэдэг (11, 12). C26 керамид нь мөөгөнцрийн эсүүдийн одоогоор үйлдвэрлэдэг гол керамид юм. Энэ нь ER-д нийлэгждэг бөгөөд ихэнх нь COPII цэврүүгээр дамжин Гольджи аппарат руу экспортлогддог (13). GPI-AP-ийн ER экспорт нь ялангуяа керамидын тасралтгүй нийлэгжилтийг шаарддаг (14, 15) бөгөөд эргээд Гольджи аппаратад керамидийг инозитол фосфатын керамид (IPC) болгон хувиргах нь GPI зангууны нийлэгжилтээс хамаардаг (16). Хиймэл мембрантай хийсэн биофизикийн судалгаагаар маш урт ацил гинжин керамидууд нь өвөрмөц физик шинж чанартай эмх цэгцтэй домэйн үүсгэхийн тулд нэгдэж чаддаг болохыг харуулсан (17, 18). Эдгээр өгөгдөл нь C26 керамид ба C26 керамидтай GPI-AP нь харьцангуй замбараагүй ER мембраны липидийн орчинд эмх цэгцтэй бүс нутаг эсвэл бүс нутгуудад нийлэхийн тулд физик шинж чанараа ашигладаг гэсэн таамаглалд хүргэдэг. Энэ нь голчлон богино ба ханаагүй глицеролипидээс (C16:1 ба C18:1) бүрдэнэ (19, 20). Эдгээр бүс нутгууд нь ER-ийн тодорхой гаралтын цэгүүд (ERES) дээр сонгон төвлөрөх бөгөөд тэнд керамид болон керамид дээр суурилсан GPI-AP-ийг ижил зориулалтын COPII цэврүүгээр Голги руу хамт тээвэрлэж болно (5).
Энэхүү судалгаанд бид флуоресцент шошготой уургуудыг нэгэн зэрэг ажиглах боломжтой дэвшилтэт микроскопийн арга болох супер нягтралтай конфокал бодит цагийн дүрслэлийн микроскоп (SCLIM) ашиглан энэхүү липид дээр суурилсан механизмыг шууд туршиж үзсэн. Гурван өнгийн болон гурван хэмжээст (3D) дүрс нь амьд эсүүдэд маш өндөр нягтралтай, хурдан байдаг (21, 22).
Бид анх SCLIM технологийг ашиглан S. cerevisiae-д ER-ээс гарсны дараа трансмембранаар ялгарсан уургуудаас C26 керамидын бүлэгтэй хэвийн GPI-AP-ийг хэрхэн шалгаж байгааг тодорхойлсон. ER-ийн ангиллыг шалгахын тулд бид in vivo ERES руу орж буй шинээр нийлэгжсэн ачааг шууд дүрслэх боломжтой генетикийн системийг ашигласан (7, 23). Ачаа болгон бид ногоон флуоресцент уураг (GFP)-ээр шошгологдсон C26 керамидад суурилсан GPI-AP Gas1 болон ойрын хэт улаан туяаны флуоресцент уураг (iRFP)-ээр шошгологдсон трансмембранаар ялгарсан Mid2 уургийг сонгосон бөгөөд хоёулаа плазмын мембраныг чиглүүлдэг (24-26). sec31-1 температурт мэдрэмтгий мутантад эдгээр хоёр ачаа нь галактозоор өдөөгддөг промотор болон ERES-ийн үндсэн тэмдэглэгээний дор илэрхийлэгддэг. Хэт өндөр температурт (37°C) sec31-1 мутаци нь COPII бүрхүүлийн бүрэлдэхүүн хэсэг Sec31-ийн COPII соёололт болон ER экспортыг дарангуйлах үйл ажиллагаанд нөлөөлдөг тул шинээр нийлэгжсэн ачаа ER дээр хуримтлагддаг (23). Бага температурт (24°C) хөргөсний дараа sec31-1 мутант эсүүд шүүрлийн хэсгээс сэргэж, хуримтлагдсан шинэ синтетик ачааг ER-ээс гаргаж эхэлсэн. CLIM дүрслэлээс харахад шинээр нийлэгжсэн Gas1-GFP болон Mid2-iRFP-ийн ихэнх нь 37°C-д инкубаци хийж, дараа нь 24°C-д 5 минутын турш суллагдсаны дараа sec31-1 мутант эсийн ER-д хуримтлагдсан хэвээр байна (Зураг 1). Mid2-iRFP нь ER мембраны бүх хэсэгт тархсан бөгөөд Gas1-GFP нь тасалдалгүй ER мембраны хэсэгт төвлөрч, цуглардаг тул тэдгээрийн тархалт огт өөр байна (Зураг 1, А-аас C ба Кино S1). Үүнээс гадна, Зураг 1D-д үзүүлсэнчлэн Gas1-GFP кластер нь Mid2-iRFP-гүй байна. Эдгээр үр дүнгээс харахад GPI-AP болон трансмембран уургууд нь ER мембраны өөр өөр хэсгүүдэд эрт ялгагдсан болохыг харуулж байна. Gas1-GFP кластер нь mCherry-ийн COPII бүрхүүлийн уураг Sec13 (Зураг 1, E ба F, мөн S1 кино)-оор тэмдэглэгдсэн тодорхой ERES-тэй зэргэлдээ оршдог (23).
sec31-1 эсүүд галактозоор өдөөгдсөн шүүрлийг илэрхийлдэг бөгөөд урт ацил гинжин хэлхээ (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) болон трансмембран уураг Mid2-iRFP (TMP, цэнхэр) нь ERES-ийн урт гинжин хэлхээ (C26) бөгөөд Sec13-mCherry (ERES, ягаан)-ийг 37°C-д 30 минут инкубацилж, 24°C руу шилжүүлж, 5 минутын дараа SCLIM-ээр дүрсэлсэн. (A-аас C хүртэл) нь хавтгайн төлөөллийн нийлсэн эсвэл ганц 2 хэмжээст дүрс (A), 10 z-хэсгийн 2 хэмжээст проекцийн дүрс (B) эсвэл ачаа болон ERES тэмдэглэгээний 3 хэмжээст эсийн хагас бөмбөрцгийн дүрсийг харуулж байна (C). Хуваарийн мөр 1μm (A ба B). Хуваарийн нэгж нь 0.551μm (C). Gas1-GFP нь салангид ER бүс нутаг эсвэл кластерт илэрсэн бол Mid2-iRFP нь ER мембраны дагуу илэрч, тархсан (C). (D) График нь цагаан сумны шугамын дагуу (зүүн талд) Gas1-GFP кластер дахь Gas1-GFP ба Mid2-iRFP-ийн харьцангуй флуоресценцийн эрчимийг харуулж байна. AU, дурын нэгж. (E ба F) нь барааг болон ERES тэмдгийг нэгтгэсэн 3 хэмжээст зургийг илэрхийлнэ. Gas1-GFP кластеруудыг тодорхой ERES-ийн ойролцоо илрүүлсэн. Хуваарийн нэгж нь 0.551μm байна. (F) Цагаан цул сум нь ERES-тэй холбоотой Gas1-GFP кластерыг тэмдэглэнэ. Дунд болон баруун самбарууд нь нэгтгэсэн томруулсан 3 хэмжээст зураг болон сонгосон Gas1-GFP кластерын эргэлдсэн харагдацыг харуулж байна.
Gas1-GFP бөөгнөрөл болон тодорхой ERES-ийн хоорондох орон зайн нягт хамаарал нь Gas1-GFP нь сонгомол ERES-д орж болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь Mid2-iRFP-ийн ER-ээс гарахад ашигладаг сонгомол чанараас өөр юм. Энэ боломжийг шийдвэрлэхийн тулд бид зөвхөн нэг эсвэл хоёр барааны ERES харьцааг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (Зураг 2, А-аас C хүртэл). Ихэнх ERES (70%) нь зөвхөн нэг төрлийн ачаа агуулдаг болохыг бид тогтоосон. Зураг 2C-ийн доод зурагт зөвхөн Gas1-GFP (Зураг 1) эсвэл зөвхөн Mid2-iRFP (Зураг 2) бүхий ERES-ийн хоёр ердийн жишээг харуулав. Үүний эсрэгээр, ERES-ийн ойролцоогоор 20% нь нэг газарт давхцсан хоёр ачаа агуулдаг. Зарим ERES (10%) нь хоёр төрлийн ачаа агуулсан боловч тэдгээр нь илт өөр өөр газарт тусгаарлагдсан болохыг тогтоожээ. Тиймээс энэхүү статистикийн шинжилгээгээр ER-ийг экспортолсны дараа GPI-AP Gas1-GFP болон трансмембран ачаа Mid2-iRFP нь өөр өөр ERES-д хуваагддаг болохыг харуулж байна (Зураг 2D). Энэхүү ялгах үр ашиг нь өмнөх биохимийн шинжилгээ (6) болон морфологийн тодорхойлолт (7)-той маш нийцэж байна. Бид мөн ERES руу орж буй хорио цээрийн ачааны зан төлөвийг ажиглаж болно (Зураг 2E ба Кино S2). Зураг 2E-д Gas1-GFP (3-р самбар) эсвэл Mid2-iRFP (4-р самбар)-ийн зөвхөн багахан хэсэг нь ERES руу нэг талаас орж, тусдаа хэсэгт хязгаарлагдсан болохыг харуулж байна. Зураг 2E-ийн 5-р самбарт Gas1-GFP болон Mid2-iRFP нь заримдаа ижил ERES-д байдаг боловч тэдгээр нь өөр өөр талаас орж, өөр өөр COPII цэврүүг төлөөлж болох тусдаа бүс нутагт төвлөрдөг болохыг харуулж байна. Мөн бид C26 керамид дээр суурилсан GPI-AP Gas1-ийг сонгомол ERES гэж ажигласан тусгаарлалт болон ангилалт нь өвөрмөц болохыг баталсан, учир нь өөр нэг трансмембран шүүрлийн ачаа болох GFP-тэмдэглэгдсэн плазмын мембраны уураг Axl2 (27) нь Mid2-iRFP-тэй ижил төстэй зан төлөвийг харуулж байна. (Зураг S1 ба Кино S3). Шинээр нийлэгжсэн Axl2-GFP нь Mid2-iRFP шиг ER мембранаар тархдаг (S1, A ба B зураг) бөгөөд ихэнх ERES-д Mid2-iRFP-тэй хамт байрладаг (S1, B-ээс D зураг хүртэл). Зураг 1-ийн 1 ба 2-р самбар. S1C нь хоёр трансмембран ачаа давхцдаг ERES-ийн хоёр ердийн жишээг харуулж байна. Эдгээр тохиолдолд хоёр бараа ERES-д хамт ордог (S1E зураг, 3-р самбар болон S3 кино).
Галактозын өдөөгддөг шүүрлийг илэрхийлдэг sec31-1 эсүүд болох Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) болон Mid2-iRFP (TMP, цэнхэр) болон Sec13-mCherry (ERES, ягаан) гэсэн бүрдүүлэгч ERES шошгыг 37°C-д байрлуулсан. °C-д 30 минут инкубацалсны дараа шүүрлийн блокийг гаргахын тулд 24°C хүртэл шилжүүлж, 20 минутын дараа SCLIM ашиглан дүрсийг гаргана. (A-аас C хүртэл) Ачааны төлөөллийн 2 хэмжээст проекцийн зураг (A; масштабын баар, 1μm) эсвэл 3 хэмжээст эсийн хагас бөмбөрцгийн зураг (B ба C; масштабын нэгж, 0.456μm) нь ERES-ээр тэмдэглэгдсэн. (B) дэх доод самбар болон (C) дэх самбар нь зөвхөн ERES-д байгаа барааг (ягаан) харуулахын тулд боловсруулсан зургийг харуулна [Gas1-GFP (саарал) болон Mid2-iRFP (цайвар цэнхэр)]. (C) Нээлттэй сум: ERES нь зөвхөн нэг ачаа тээвэрлэдэг (1-ээс 4 хүртэл). Саарал сум: ERES нь тусгаарлагдсан ачаа агуулдаг (5). Цагаан өнгийн цул сум: ERES нь зэрэгцсэн ачаа агуулсан. Доор: Сонгосон ганц ERES нь зөвхөн Gas1-GFP (1) эсвэл Mid2-iRFP (2) агуулдаг. Масштабын шугам, 100 нм. (D) (C)-д тайлбарласан фотомикрографын тоон үзүүлэлт. Зөвхөн нэг ачаа (Gas1-GFP эсвэл Mid2-iRFP), тусгаарлагдсан ачаа болон давхцсан ачаа агуулсан ERES-ийн дундаж хувь. Гурван бие даасан туршилтаар 54 нүдэнд n=432 байна. Алдааны шугам = SD. Хоёр сүүлт хослоогүй t тест. *** P = 0.0002. (E) (C) тэмдэглэгдсэн тусгаарлагдсан ачааны сонгосон ERES-ийн 3 хэмжээст дүрс. Gas1-GFP (ногоон) (3) эсвэл Mid2-iRFP (цэнхэр) (4) нь ERES (нил ягаан)-д нэг талаас орж, ERES доторх жижиг хэсэгт хязгаарлагддаг. Заримдаа хоёр төрлийн ачаа нэг талаас нэг ERES (5) руу орж, ERES доторх тусгаарлагдсан хэсэгт хязгаарлагддаг. Масштабын шугам, 100 нм.
Дараа нь бид ER мембранд байдаг урт ацил гинжин керамид (C26) нь Gas1-ийн тодорхой кластерчлал болон ялгалтыг сонгомол ERES болгон хөтөлдөг гэсэн таамаглалыг туршсан. Үүний тулд бид өөрчлөгдсөн мөөгөнцрийн GhLag1 омгийг ашигласан бөгөөд үүнд хоёр эндоген керамидын синтаз болох Lag1 ба Lac1-ийг GhLag1 (хөвөнгийн Lag1 гомолог)-оор сольсон бөгөөд үүний үр дүнд эсийн мембраны керамидын омог нь зэрлэг төрлөөс богино байдаг (Зураг 3A) (28). Массын спектрометрийн (MS) шинжилгээгээр зэрлэг төрлийн омгуудад нийт керамидын 95% нь маш урт (C26) гинжин керамид байдаг бол GhLag1-д керамидын 85% нь маш урт (C18 ба C16) байдаг. ), керамидын зөвхөн 2% нь маш урт (C26) гинжин керамид байдаг. Хэдийгээр C18 ба C16 керамидууд нь одоогоор GhLag1 мембранд илэрсэн гол керамидууд боловч MS шинжилгээгээр GhLag1 омогт илэрхийлэгдсэн Gas1-GFP-ийн GPI зангуу нь зэрлэг төрлийн липидтэй харьцуулах боломжтой C26 керамид агуулдаг болохыг баталсан. Чанар нь ижил байна (Зураг 3A) (26). Тиймээс энэ нь керамидын өөрчлөлтийн фермент Cwh43 нь C26 керамидын хувьд өндөр сонгомол гэсэн үг бөгөөд Зураг 26-д үзүүлсэн шиг GhLag1 омгийн бага хэмжээний C26 керамидын GPI зангууг илүүд үздэг. S2 (29). Гэсэн хэдий ч GhLag1-ийн эсийн мембран нь үндсэндээ зөвхөн C18-C16 керамид агуулдаг бол Gas1-GFP нь C26 керамид агуулдаг хэвээр байна. Энэ баримт нь энэ омгийг ER дахь мембраны керамидын ацил гинжин хэлхээний уртын асуудлыг тусгайлан шийдвэрлэх хамгийн тохиромжтой хэрэгсэл болгодог. Ангилал ба ялгах таамаглалын үүрэг. Дараа нь бид эхлээд уламжлалт флуоресценцийн микроскопоор дамжуулан C26 Gas1-GFP-ийн sec31-1 температурт мэдрэмтгий мутант аллель бүхий GhLag1-д кластер хэлбэрээр хуримтлагдах чадварыг судалсан бөгөөд зөвхөн урт (C18-C16) гинж нь ER мембраны Ceramide-д байдаг (Зураг 3). Бид sec31-1-д Gas1-GFP-ийн ихэнх хэсэг нь кластер хэлбэрээр төвлөрсөн бол урт (C18-C16) урт керамидын ER мембрантай sec31-1 GhLag1-д Gas1-GFP нь ER мембраны бүхэлдээ кластер хэлбэрээр тархаагүй, тархаагүй болохыг ажигласан. Тодруулбал, C26 керамидад суурилсан кластерчлал нь тодорхой ERES-тэй нягт холбоотой тул (Зураг 1) бид дараа нь энэ үйл явц нь ER экспортын уургийн механизмын функцийг хамарч болох эсэхийг судалсан. GPI-AP нь ER экспортод зориулсан тусгай COPII системийг ашигладаг бөгөөд үүнийг GPI зангууны гликан хэсгийн Ted1-ийн бүтцийн өөрчлөлтөөр идэвхтэй зохицуулдаг (30, 31). Рекомбинант GPI-гликаныг дараа нь трансмембран ачааны рецептор p24 цогцолбороор таньдаг бөгөөд энэ нь эргээд COPII ачааны холболтын гол дэд нэгж Sec24-ийн тодорхой изоформ болох Lst1-ийг сонгон элсүүлж, GPI-AP-ээр баялаг COPII цэврүүг үүсгэдэг (31-33). Тиймээс бид эдгээр дан уургуудын (p24 цогцолборын бүрэлдэхүүн хэсэг Emp24, GPI-гликаны өөрчлөлтийн фермент Ted1 болон тодорхой COPII дэд нэгж Lst1) устгалыг sec31-1 мутант омогтой хослуулсан давхар мутантыг бүтээж, тэдгээрийг судалсан. Gas1-кластер GFP үүсгэх боломжтой юу (Зураг 3). Бид sec31-1emp24Δ болон sec31-1ted1Δ-д Gas1-GFP нь голчлон бөөгнөрөлгүй бөгөөд ER мембран даяар тархсан болохыг ажигласан бөгөөд өмнө нь sec31-1 GhLag1-д ажиглагдсан байсан бол sec31-1lst1Δ-д Gas1-GFP нь sec31-1 шиг байна. Эдгээр үр дүнгүүд нь ER мембранд C26 керамид байгаагаас гадна Gas1-GFP-ийн бөөгнөрөл нь p24 цогцолбортой холбогдох шаардлагатай бөгөөд тусгай Lst1 элсэлт шаарддаггүй болохыг харуулж байна. Дараа нь бид ER мембран дахь керамидын гинжин урт нь Gas1-GFP-ийн p24-тэй холбогдохыг зохицуулж чадах боломжийг судалсан. Гэсэн хэдий ч мембранд C18-C16 керамид байгаа нь p24 цогцолбороор сэргээгдсэн GPI-гликануудад (S3 ба S4, A ба B зураг) эсвэл GPI-AP-тай холбогдож, GPI-AP экспортлох чадварт нөлөөлдөггүй болохыг бид тогтоосон. COPII дэд хэв шинж Lst1-ийг элсүүлнэ (Зураг S4C). Тиймээс C26 керамидаас хамааралтай кластерчлал нь уургийн өөр өөр ER экспортын уургийн механизмтай харилцан үйлчлэлцэхийг шаарддаггүй боловч липидийн уртаар удирддаг өөр ангилах механизмыг дэмждэг. Дараа нь бид ER мембран дахь керамидын ацил гинжин хэлхээний урт нь Gas1-GFP-ийг сонгомол ERES гэж үр дүнтэй ангилахад чухал эсэхийг шинжилсэн. Богино гинжин керамидтай GhLag1 омгийн Gas1 нь ER-ээс гарч, плазмын мембран руу ордог тул (Зураг S5), хэрэв ангилах нь керамидын ацил гинжин хэлхээний уртаар удирддаг бол GhLag1 омгийн Gas1-ийг дахин чиглүүлж, огтлолцож болно гэж бид үзэж байна. Ижил мембрантай ERES бараа.
(A) GhLag1-ийн эсийн мембран нь голчлон богино C18-C16 керамид агуулдаг бол Gas1-GFP-ийн GPI зангуу нь зэрлэг төрлийн эсүүдтэй ижил C26 IPC-тэй хэвээр байна. Дээрх зураг: зэрлэг төрлийн (Wt) болон GhLag1p омгийн эсийн мембран дахь керамидын ацил гинжин хэлхээний уртын шинжилгээг массын спектрометрээр (MS) хийсэн. Өгөгдөл нь нийт керамидын хувийг илэрхийлнэ. Гурван бие даасан туршилтын дундаж. Алдааны мөр = SD. Хоёр сүүлт хослоогүй t тест. **** P <0.0001. Доод самбар: Зэрлэг төрөл болон GhLag1p омгуудад илэрхийлэгдсэн Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI зангуунд байгаа IPC-ийн ацил гинжин хэлхээний уртын MS шинжилгээ. Өгөгдөл нь нийт IPC дохионы хувийг илэрхийлнэ. Таван бие даасан туршилтын дундаж. Алдааны мөр = SD. Хоёр сүүлт хослоогүй t тест. ns, чухал биш. P = 0.9134. (B) Галактозоор өдөөгдсөн Gas1-GFP илэрхийлсэн sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ болон sec31-1lst1Δ эсүүдийн флуоресценцийн микрографийг 37°C-д 30 минутын турш инкубацилж, 24°C-ийн дараа ердийн флуоресценцийн микроскоп хийхээр шилжүүлсэн. Цагаан сум: ER Gas1-GFP бөөгнөрөл. Нээлттэй сум: Бөглөөгүй Gas1-GFP нь ER мембраны бүх хэсэгт тархсан бөгөөд ER-ийн онцлог цөмийн цагираг будалтыг харуулж байна. Хуваарийн зураас, 5μm. (C) (B)-д тайлбарласан фотомикрографийн тоон үзүүлэлт. Gas1-GFP цэгэн бүтэцтэй эсүүдийн дундаж хувь. Гурван бие даасан туршилтаар n≥300 эс. Алдааны зураас = SD. Хоёр сүүлт хосгүй t тест. **** P <0.0001.
Энэ асуудлыг шууд шийдэхийн тулд бид sec31-1 температурт мэдрэмтгий мутант аллель бүхий GhLag1 дахь Gas1-GFP болон Mid2-iRFP-ийн SCLIM дүрслэлийг хийсэн (Зураг 4 ба Кино S4). ER-ийг 37°C-д хадгалж, дараа нь 24°C-д гаргасны дараа шинээр нийлэгжсэн Gas1-GFP-ийн ихэнх хэсэг нь ER мембран даяар бөөгнөрөлгүй, тархаагүй бөгөөд үүнийг уламжлалт микроскопоор ажигласан (Зураг 4, A ба B). Үүнээс гадна, ERES-ийн дийлэнх хувь (67%) нь түүн дотор хамт байрладаг хоёр төрлийн ачааг агуулдаг (Зураг 4D). Зураг 4C-ийн 1 ба 2-р самбаруудад Gas1-GFP болон Mid2-GFP давхцсан ERES-ийн хоёр ердийн жишээг харуулав. Үүнээс гадна, хоёр барааг ижил ERES-д элсүүлсэн (Зураг 4E, 3-р самбар ба Кино S4). Тиймээс бидний үр дүнгээс харахад ER мембран дахь керамидын ацил гинжин хэлхээний урт нь ER уургийн агрегаци ба ангиллын чухал хүчин зүйл болдог.
Sec31-1 Галактозоор өдөөгдсөн шүүрэл илэрхийлдэг GhLag1 эсүүд, Gas1-GFP (GPI-AP, ногоон) болон Mid2-iRFP (TMP, цэнхэр) болон ERES-ээр тэмдэглэгдсэн Sec13-mCherry (ERES, ягаан)-ийг 37°C-д өсгөвөрлөнө. 30 минут үргэлжлүүлж, шүүрэл ялгаруулахын тулд 24°C хүртэл бууруулж, 20 минутын дараа SCLIM-ээр дүрслэнэ. (A-аас C хүртэл) Ачаа болон ERES-ээр тэмдэглэгдсэн 10 z-хэсгийн төлөөллийн 2 хэмжээст проекцийн зураг (A; масштабын баар, 1μm) эсвэл 3 хэмжээст эсийн хагас бөмбөрцгийн зураг (B ба C; масштабын нэгж, 0.45μm). (B) дэх доод самбар болон (C) дэх самбар нь зөвхөн ERES-д байгаа барааг (ягаан) харуулахын тулд боловсруулсан зургийг харуулна [Gas1-GFP (саарал) болон Mid2-iRFP (цайвар цэнхэр)]. (C) Цагаанаар дүүргэсэн сум: ERES, бараанууд давхцаж байна. Нээлттэй сум: ERES нь зөвхөн нэг зүйл агуулж байна. Доод самбар: Сонгосон ERES нь (C)-д тэмдэглэгдсэн давхцсан бараатай (1 ба 2) байна. Масштабын мөр, 100 нм. (D) (C)-д тайлбарласан фотомикрографын тоон үзүүлэлт. sec31-1 ба sec31-1 GhLag1 нэгжид зөвхөн нэг ачаа (Gas1-GFP эсвэл Mid2-iRFP), мөн тусгаарлагдсан ачаа болон давхцсан ачааны ERES-ийн дундаж хувийг оруулсан болно. Гурван бие даасан туршилтаар 54 нүдэнд n = 432 (sec31-1) ба 47 нүдэнд n = 430 (sec31-1 GhLag1). Алдааны мөр = SD. Хоёр сүүлт хосгүй t тест. *** P = 0.0002 (sec31-1) ба ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) (C)-д тэмдэглэгдсэн давхцсан ачаатай (3) сонгосон ERES-ийн 3 хэмжээст дүрс. Gas1-GFP (ногоон) болон Mid2-iRFP (цэнхэр) нь ERES (нил ягаан)-д нэг талаас ойртож, ижил ERES-ийн хязгаарлагдмал бүсэд байрлана. Масштабын шугам, 100 нм.
Энэхүү судалгаа нь липид дээр суурилсан уургийн ачааг ялгаруулах замд сонгомол экспортын цэгүүдэд ангилдаг болохыг in vivo шууд нотлох баримтыг өгч, ангиллын сонгомол байдалд ацил гинжин хэлхээний уртын ач холбогдлыг харуулж байна. SCLIM гэж нэрлэгддэг хүчирхэг, дэвшилтэт микроскопийн аргыг ашиглан бид мөөгөнцрийн шинээр нийлэгжүүлсэн Gas1-GFP (маш урт ацил гинжин хэлхээ (C26) керамидын липидийн хэсэг бүхий гол плазмын мембран GPI-AP)-ийг харуулсан. Дискрет ER-д бөөгнөрсөн бүсүүд нь тодорхой ERES-тэй холбоотой байдаг бол трансмембранаар ялгардаг уургууд ER мембран даяар тархдаг (Зураг 1). Үүнээс гадна эдгээр хоёр төрлийн бараа нь өөр өөр ERES-д сонгомол байдлаар ордог (Зураг 2). Мембран дахь эсийн керамидын ацил гинжин хэлхээний урт C26-аас C18-C16 болж буурч, Gas1-GFP кластер нь дискрет ER бүсэд задарч, Gas1-GFP нь ижил ERES-ээр дамжин трансмембран уурагтай ER-ээс гарахын тулд дахин чиглүүлэгддэг (Зураг 3 ба Зураг 3). 4).
GPI-AP нь ER-ээс гарахын тулд тусгай уургийн механизмыг ашигладаг боловч C26 керамидаас хамааралтай салалт нь ERES-ийн мэргэшүүлэлтэд хүргэж болзошгүй уургийн харилцан үйлчлэлээс хамаардаггүй болохыг бид тогтоосон (S4 ба S5 зураг). Үүний оронд бидний олдворууд нь липид дээр суурилсан уургийн кластерчлал болон дараа нь бусад ачааг хасах замаар удирддаг өөр ангиллын механизмыг дэмжиж байна. Бидний ажиглалтууд нь тодорхой ERES-тэй холбоотой Gas1-GFP бүс нутаг эсвэл кластерт трансмембранаар ялгардаг Mid2-iRFP уураг дутагдаж байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь C26 керамидаас хамааралтай GPI-AP кластер нь холбогдох ERES-д нэвтрэхийг хөнгөвчлөх бөгөөд үүний зэрэгцээ трансмембраныг хасдаг болохыг харуулж байна. Шүүрэл нь энэхүү тодорхой ERES-д ордог (Зураг 1 ба 2). Үүний эсрэгээр, ER мембранд C18-C16 керамидууд байгаа нь GPI-AP-ийг бүс нутаг эсвэл кластер үүсгэхэд хүргэдэггүй тул тэдгээр нь трансмембранаар ялгардаг уургуудыг ижил ERES руу хасдаггүй эсвэл орлуулдаггүй (Зураг 3 ба 4). Тиймээс бид C26 керамид нь тодорхой ERES-тэй холбогдсон уургуудын кластерчлалыг хөнгөвчилснөөр ялгарал ба ангиллыг удирддаг гэж үзэж байна.
Энэхүү C26 керамидаас хамааралтай бөөгнөрөлийг тодорхой ER хэсэгт хэрхэн бий болгох вэ? Мембран керамидын хажуу тийшээ салах хандлага нь GPI-AP болон C26 керамид нь богино, ханаагүй глицеролипид агуулсан ER мембраны илүү жигд бус липидийн орчинд жижиг, агшин зуурын дараалсан липид үүсгэхэд хүргэдэг. Чанарын бөөгнөрөл (17, 18). Эдгээр жижиг түр зуурын бөөгнөрөл нь p24 цогцолбортой холбогдсоны дараа илүү том, илүү тогтвортой бөөгнөрөл болж нийлж болно (34). Үүнтэй уялдуулан бид C26 Gas1-GFP нь илүү том харагдахуйц бөөгнөрөл үүсгэхийн тулд p24 цогцолбортой харилцан үйлчлэх шаардлагатайг харуулсан (Зураг 3). p24 цогцолбор нь мөөгөнцрийн дөрвөн өөр p24 трансмембран уургаас бүрдсэн гетерозигот олигомер юм (35), энэ нь олон валенттай холболтыг хангадаг бөгөөд энэ нь жижиг GPI-AP бөөгнөрөлүүдийн хөндлөн холболтод хүргэж, улмаар илүү том Тогтвортой бөөгнөрөл үүсгэдэг (34). Хөхтөн амьтдын туйлширсан хучуур эдийн эсүүдэд Голги тээвэрлэлтийн явцад GPI-AP-ийн уургийн эктодомэйнуудын харилцан үйлчлэл нь тэдгээрийн агрегацид хувь нэмэр оруулж болох бөгөөд энэ нь хөхтөн амьтдын туйлширсан хучуур эдийн эсүүдэд Голги тээвэрлэлтийн явцад харагдаж байна (36). Гэсэн хэдий ч ER мембранд C18-C16 керамид байх үед p24 цогцолбор нь Gas1-GFP-тэй холбогдох үед том тусдаа бөөгнөрөл үүсэхгүй. Үндсэн механизм нь урт ацил гинжин керамидын тодорхой физик, химийн шинж чанараас хамаарч болно. Хиймэл мембраны биофизикийн судалгаагаар урт (C24) болон богино (C18-C16) ацил гинжин керамидууд хоёулаа фазын салалтыг үүсгэж болох боловч зөвхөн урт ацил гинжин керамидууд (C24) нь өндөр муруйлт болон хальсны нугалалтыг дэмжиж, хальсны хэлбэрийг өөрчилдөг болохыг харуулж байна. Харилцан лавлагаагаар дамжуулан (17, 37, 38). Emp24-ийн хүний ​​гомолог болох TMED2-ийн трансмембран спираль нь цитоплазмын дэлбээнд C18 керамид дээр суурилсан сфингомиелинтэй сонгомол харилцан үйлчилдэг болохыг харуулсан (39). Молекулын динамик (MD) симуляцийг ашиглан бид C18 болон C26 керамидууд хоёулаа Emp24 трансмембран спиралийн цитоплазмын дэлбээнд хуримтлагддаг бөгөөд тэдгээр нь ижил төстэй сонголттой болохыг тогтоосон (Зураг S6). Энэ нь Emp24-ийн трансмембран спираль нь мембран дахь липидийн тэгш бус тархалтад хүргэж болзошгүйг харуулж байгааг тэмдэглэх нь зүйтэй. Энэ бол хөхтөн амьтдын эсүүд дээр үндэслэсэн саяхны үр дүн юм. Үүнтэй төстэй MD симуляци нь эфирийн липид байгааг харуулж байна (40). Тиймээс бид ER26-ийн хоёр дэлбээнд байгаа C26 керамид нь орон нутагт баяжсан гэж таамаглаж байна. Гэрлийн дэлбээнд байрлах GPI-AP нь олон валенттай p24-тэй шууд холбогдож, цитоплазмын дэлбээнд p24-ийн эргэн тойронд C26 керамид хуримтлагдахад энэ нь дагалдах уургийн агрегацийг дэмжиж, мембраны муруйлтыг хуруугаар дамжуулан үүсгэдэг (41) бөгөөд энэ нь GPI-AP нь ERES-тэй зэргэлдээх салангид хэсгүүдэд хуваагдахад хүргэдэг бөгөөд энэ нь ER мембраны өндөр муруй хэсгүүдийг дэмждэг (42). Өмнөх тайлангууд нь санал болгож буй механизмыг дэмжиж байсан (43, 44). Сийвэнгийн мембран дээр олиголектин, эмгэг төрүүлэгчид эсвэл эсрэгбие нь керамид дээр суурилсан гликосфинголипид (GSL)-тэй олон валенттай холбогддог нь GSL-ийн их хэмжээний агрегацийг өдөөж, фазын тусгаарлалтыг сайжруулж, мембраны деформаци ба дотоод байдлыг үүсгэдэг (44). Ивабучи гэх мэт (43) Урт (C24) боловч богино (C16) биш ацил гинж байгаа үед GSL лактосилцерамидтай холбогдсон олон валенттай лиганд нь том бөөгнөрөл үүсч, мембраны инвагинацияг өдөөдөг бөгөөд цитоплазм нь навчнууд дээрх Lyn-зуучлалтай дохионы дамжуулалт нь холбогдсон нейтрофилуудад ацил гинжээр хоорондоо холбогддог болохыг тогтоожээ.
Хөхтөн амьтдын туйлширсан хучуур эдийн эсүүдэд Гольгийн эсрэг сүлжээ (TGN)-ийн концентраци нь оройн плазмын мембраны түвшинд GPI-AP-ийн ялгарал, ялгалтыг хянадаг (10, 45). Энэхүү нэгтгэлт нь GPI-AP олигомержилтээр өдөөгддөг (36) боловч энэ нь мөөгөнцрийн керамидын гинжин хэлхээний уртаас хамаарч болно. Хэдийгээр хөхтөн амьтдын GPI-AP нь эфир липид дээр суурилсан зангуутай бөгөөд химийн бүтэц нь маш урт ацил гинжин керамидаас маш өөр боловч саяхны нэгэн судалгаагаар липидүүд хоёулаа хувьслын хувьд ижил төстэй физик, химийн шинж чанар, үйл ажиллагаатай болохыг тогтоожээ (40). Тиймээс хөхтөн амьтдын эсийн эфир липидийн хэсэг нь мөөгөнцрийн C26 керамидтай төстэй байж болох бөгөөд түүний үүрэг нь мембран дахь урт гинжин керамидтай холбогдож GPI-AP нэгтгэл, ялгалтыг дэмжих явдал юм. Хэдийгээр энэ боломжийг шууд турших шаардлагатай хэвээр байгаа ч өмнөх олдворууд нь урт ацил гинжин керамидыг Голги биед тээвэрлэх нь цитоплазмын дамжуулалтын уургуудаар хийгддэггүй, харин мөөгөнцрийн нэгэн адил GPI зангууны нийлэгжилтээс хамаардаг болохыг баталж байна. Тиймээс хувьслын консерватив механизм нь маш урт ацил гинжин керамид болон GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47)-ийг ижил тээвэрлэлтийн цэврүүт сонгомол байдлаар хамтран тээвэрлэх чадвартай юм шиг байна.
Мөөгөнцөр болон хөхтөн амьтдын туйлширсан хучуур эдийн эсийн системд GPI-AP агрегаци болон бусад плазмын мембраны уургуудаас тусгаарлагдах нь эсийн гадаргууд хүрэхээс өмнө явагддаг. Паладино нар (48) хөхтөн амьтдын туйлширсан хучуур эдийн эсийн TGN дээр GPI-AP кластерчлал нь зөвхөн оройн плазмын мембранд GPI-AP-ийг сонгон ангилахад шаардлагатай төдийгүй GPI-AP-ийн кластерын зохион байгуулалт болон түүний биологийн идэвхийг зохицуулдаг болохыг тогтоожээ. Эсийн гадаргуу. Мөөгөнцрийн хувьд энэхүү судалгаагаар ER дээрх C26 керамидаас хамааралтай GPI-AP кластер нь плазмын мембран дээрх GPI-AP-ийн кластерын зохион байгуулалт болон үйл ажиллагааны идэвхийг зохицуулж чаддаг болохыг харуулсан (24, 49). Энэхүү загвартай нийцэж байгаа GhLag1 эсүүд нь GPI дарангуйлагч эсвэл эсийн ханын бүрэн бүтэн байдалд нөлөөлдөг эмэнд харшилтай байдаг (28) бөгөөд мөөгөнцрийн эсийн нийлэгжилтэд төсөөлөгдсөн үзүүрийн керамидын үйл ажиллагааны Gas1-GFP кластеруудын хэрэгцээ (49) нь G-ийг харуулж байна. hLag1 эсийн болзошгүй физиологийн үр дагавар. GPI-AP алдаа. Гэсэн хэдий ч эсийн гадаргуугийн функциональ зохион байгуулалтыг липидийн уртад суурилсан ялгах аргаар ER-ээс програмчилсан эсэхийг цаашид шалгах нь бидний ирээдүйн судалгааны сэдэв болно.
Энэхүү ажилд ашигласан Saccharomyces cerevisiae омгуудыг S1 хүснэгтэд жагсаасан болно. Амьд эсийн дүрслэлд зориулсан SCLIM-ийн MMY1583 ба MMY1635 омгуудыг W303-ийн дэвсгэр дээр бүтээсэн. Флуоресцент уургийн шошготой Sec13-mCherry-г илэрхийлсэн эдгээр омгуудыг pFA6a плазмидыг загвар болгон ашиглан полимеразын гинжин урвал (PCR) дээр суурилсан аргыг ашиглан бүтээсэн (23). GAL1 промоторын хяналтан дор флуоресцент уургаар тэмдэглэгдсэн Mid2-iRFP илэрхийлсэн омгийг дараах байдлаар бүтээсэн. pKTiRFP-KAN вектороос iRFP-KanMx дарааллын PCR олшруулалт (E. O'Shea-ийн бэлэг, Addgene плазмид дугаар 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; судалгааны нөөцийн танигч (RRID): Addgene_64687) Мөн эндоген Mid2-ийн С-төгсгөлд оруулсан. Mid2-iRFP геномын дарааллыг олшруулж, GAL1 промоторт клончилсны дараа үүнийг pRS306 интеграцийн плазмидийн Not I-Sac I хэсэгт нэгтгэсэн. Үүссэн pRGS7 плазмидийг URA3 локус руу нэгтгэхийн тулд Pst I-тэй шугаман болгосон.
Gas1-GFP нэгдлийн ген нь центромер (CEN) плазмид дахь GAL1 промоторын хяналтан дор илэрхийлэгддэг бөгөөд үүнийг дараах байдлаар бүтээдэг. Gas1-GFP дарааллыг pRS416-GAS1-GFP плазмид (24) (Л. Попологийн бэлэг)-ээс PCR-ээр олшруулж, CEN плазмидын pBEVY-GL LEU2 (C-ийн бэлэг)-ийн Xma I–Xho I хэсэгт клончилсон. Миллер; Адджен плазмидын дугаар 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Үүссэн плазмидийг pRGS6 гэж нэрлэсэн. Axl2-GFP нэгдлийн генийг мөн pBEVY-GL LEU2 векторын GAL1 промоторын хяналтан дор илэрхийлдэг бөгөөд түүний бүтэц дараах байдалтай байна. Axl2-GFP дарааллыг pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмид (23)-аас PCR аргаар олшруулж, pBEVY-GL LEU2 векторын Bam HI-Pst I сайт руу клончилсон. Үүссэн плазмидийг pRGS12 гэж нэрлэсэн. Энэхүү судалгаанд ашигласан олигонуклеотидын дарааллыг S2 хүснэгтэд жагсаасан болно.
Уг омгийг нүүрстөрөгчийн эх үүсвэр болгон 0.2% аденин болон 2% глюкоз [YP-декстроз (YPD)], 2% рафиноз [YP-рафиноз]-оор баялаг мөөгөнцрийн хандтай уургийн p (YP) орчин (1% мөөгөнцрийн ханд болон 2% уураг ept). (YPR)] эсвэл 2% галактоз [YP-галактоз (YPG)]-аар, эсвэл тэжээлд шаардлагатай зохих амин хүчил болон суурийг нөхөхийн тулд синтетик минималь орчинд (0.15% мөөгөнцрийн азотын суурь болон 0.5% аммонийн сульфат) нэмж, нүүрстөрөгчийн эх үүсвэр болгон 2% глюкоз (синтетик глюкозын минималь орчин) эсвэл 2% галактоз (синтетик галактозын минималь орчин) агуулсан.
Бодит цагийн дүрслэлийн хувьд GAL1 промоторын дор бүтцийг илэрхийлдэг температурт мэдрэмтгий sec31-1 мутант эсүүдийг YPR орчинд 24°C-д шөнийн турш логарифмын дунд үе хүртэл ургуулсан. YPG-д 24°C-д 1 цагийн турш индукц хийсний дараа эсүүдийг SG-д 37°C-д 30 минут инкубацилж, дараа нь шүүрлийн блокоос гаргахын тулд 24°C-д шилжүүлсэн. Конканавалин А-г ашиглан эсүүдийг шилэн слайд дээр бэхлэж, SCLIM-ээр дүрсэлсэн. SCLIM нь Olympus IX-71 урвуу флуоресценцийн микроскоп болон UPlanSApo 100×1.4 тоон диафрагмын тосны линз (Olympus), өндөр хурдтай болон өндөр дохио-шуугианы харьцаатай эргэлдэгч диск конфокал сканнер (Yokogawa Electric), захиалгат спектрометр, захиалгат хөргөлтийн хослол юм. Системийн дүрсний өсгөгч (Hamamatsu Photonics) нь ×266.7 эцсийн томруулалттай томруулдаг линзний систем болон электроныг үржүүлдэг цэнэгтэй холбогдсон төхөөрөмжийн камер (Hamamatsu Photonics) (21)-ийг хангаж чадна. Зургийг олж авах ажлыг захиалгат програм хангамж (Yokogawa Electric) гүйцэтгэдэг. 3 хэмжээст зургийн хувьд бид захиалгат пьезоэлектрик идэвхжүүлэгч ашиглан объектив линзийг босоо чиглэлд чичиргэж, оптик хэсгүүдийг 100 нм зайтай стек болгон цуглуулсан. Z-стек зургийг 3 хэмжээст вокселийн өгөгдөл болгон хувиргадаг бөгөөд эргэлдэгч диск конфокал микроскопт ашигласан онолын цэгийн тархалтын функцийг Volocity програм хангамж (PerkinElmer)-ээр деконволюцийн боловсруулалтад ашигладаг. Volocity програм хангамжийг ашиглан хамтын байршлын шинжилгээний босгыг автоматаар хэмжсэн бөгөөд ачаа зэрэг ERES-ийг хэмжсэн. Шугамын скан шинжилгээг MetaMorph програм хангамж (Molecular Devices) ашиглан хийсэн.
Статистикийн ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд GraphPad Prism програм хангамжийг ашиглана уу. Хоёр талт Оюутны t-тест болон ердийн нэг талын дисперсийн шинжилгээний (ANOVA) тестийн хувьд бүлгүүдийн хоорондох ялгаа нь P <0.05 (*)-д мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлдэг гэж үздэг.
Gas1-GFP-ийн флуоресценцийн микроскопийн хувьд логарифмын фазын эсүүдийг YPD-д шөнийн турш ургуулж, центрифугээр цуглуулж, фосфатын буфержуулсан давсны уусмалаар хоёр удаа угааж, мөсөн дээр дор хаяж 15 минут инкубаци хийж, дараа нь өмнө нь тайлбарласны дагуу микроскопоор үргэлжлүүлсэн (24). Объектив линз, L5 (GFP) шүүлтүүр, Hamamatsu камер болон Application Suite X (LAS X) програм хангамжаар тоноглогдсон Leica DMi8 микроскоп (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS)-ийг олж авахад ашигласан.
Дээжийг SDS дээжийн буфераар 65°C-д 10 минутын турш денатурацид оруулж, дараа нь SDS-полиакриламидын гель электрофорезоор (PAGE) тусгаарласан. Иммуноблоттингийн шинжилгээнд нэг замд 10 мкл дээж ачаалсан. Анхдагч эсрэгбие: Туулайн поликлональ анти-Gas1-ийг 1:3000 шингэрүүлэлтээр, туулайн поликлональ анти-Emp24-ийг 1:500 шингэрүүлэлтээр, туулайн поликлональ анти-GFP (Х. Риезманы бэлэг)-ийг 1:3000 шингэрүүлэлтээр ашиглана. Хулганы моноклональ анти-Pgk1 эсрэгбиеийг 1:5000 шингэрүүлэлтээр (Ж. де ла Крузын бэлэг) ашигласан. Хоёрдогч эсрэгбие: Тунхууны пероксидаз (HRP)-тай коньюгат ямааны туулайн эсрэг иммуноглобулин G (IgG)-ийг 1:3000 шингэрүүлэлтээр (Пирс) ашигласан. HRP-тэй холбосон ямааны хулганы эсрэг IgG-ийг 1:3000 (Пирс) шингэрүүлэлтээр ашигласан. Дархлааны хариу урвалын бүсийг SuperSignal West Pico урвалжийн (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценцийн аргаар ажигласан.
(31)-д дурдсанчлан, баяжуулсан ER фракц дээр байгалийн дархлаа тунадасжуулах туршилт хийсэн. Товчхондоо, мөөгөнцрийн эсийг TNE буфер [50 мМ трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонил фтор ба протеазын дарангуйлагчийн холимог)-аар 600 нм (OD600)-д 100 оптик нягтралтайгаар хоёр удаа угаана. Үүнийг шилэн бөмбөлгөөр хугалж, дараа нь эсийн үлдэгдэл болон шилэн бөмбөлгүүдийг центрифугээр зайлуулна. Дараа нь дээд давхаргыг 17,000 г-д 4°C-д 15 минутын турш центрифугээр зайлуулна. Үрлэнг TNE-д дахин суспензлэж, дигиталис сапониныг 1%-ийн эцсийн концентрацитай болтол нэмнэ. Суспензийг 4°C-д 1 цагийн турш эргүүлж, дараа нь уусдаггүй бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг 13,000 г-д 4°C-д 60 минутын турш центрифугээр зайлуулна. Gas1-GFP иммунопресипитацийн хувьд эхлээд дээжийг хоосон агарозын бөмбөлгүүдээр (ChromoTek) 4°C-д 1 цагийн турш урьдчилан инкубацилж, дараа нь GFP-Trap_A (ChromoTek)-ээр 4°C-д 3 цагийн турш инкубацилав. Дархлаажуулсан бөмбөлгүүдийг 0.2% дигоксигенин агуулсан TNE-ээр таван удаа угааж, SDS дээжийн буферээр элюцилж, SDS-PAGE дээр ялгаж, иммуноблоттингоор шинжилсэн.
(31)-д тайлбарласны дагуу баяжуулсан ER фракц дээр хөндлөн холбоос тодорхойлох ажлыг гүйцэтгэсэн. Товчхондоо, баяжуулсан ER фракцийг 0.5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат)-аар инкубацлав (Пирс, Термо Фишер Сайенфик, Рокфорд, Иллинойс, АНУ; 20°C, 20 минут). Хөндлөн холбоосын урвалыг глицин (50 мМ эцсийн концентраци, 5 минут, 20°C) нэмснээр унтраасан.
Өмнө нь тайлбарласны дагуу (50), зэрлэг төрөл ба GhLag1 омгийн керамидын MS шинжилгээг хийсэн. Товчхондоо, эсүүдийг 30°C-д YPD-д экспоненциал фаз (3-4 OD600 нэгж/мл) хүртэл өсгөж, 25×107 эсийг хураан авсан. Тэдний бодисын солилцоог трихлорцууны хүчилээр унтраана. Экстракт уусгагч [этанол, ус, эфир, пиридин ба 4.2 Н аммонийн гидроксид (15:15:5:1:0.018 v/v)] болон дотоод стандарт C17 керамидын 1.2 нмоль (860517, Avanti туйлын липид) чанартай хэрэглэнэ. Хандсыг бага зэрэг шүлтлэг гидролиз хийхийн тулд монометиламин урвалж [метанол, ус, n-бутанол ба метиламин уусмал (4:3:1:5 v/v)] ашиглан давсгүйжүүлж, дараа нь усаар ханасан n-бутанол ашиглан давсгүйжүүлнэ. Эцэст нь хандыг эерэг горимын уусгагчид [хлороформ/метанол/ус (2:7:1) + 5 мМ аммонийн ацетат] дахин уусгаж, массын спектрометрт шахав. Сфинголипидын молекулуудыг тодорхойлох, тоон үзүүлэлт гаргахын тулд олон урвалын хяналт (MRM) хийсэн. TSQ Vantage гуравдагч квадрупол массын спектрометр (Thermo Fisher Scientific) нь липидийн шинжилгээнд зориулагдсан робот нано урсгалын ионы эх үүсвэр болох Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY)-ээр тоноглогдсон. Мөргөлдөөний энергийг керамидын ангилал бүрт оновчтой болгосон. MS өгөгдлийг эерэг горимд авсан. Биологийн давталт бүрийн хувьд липидийн дохио нь гурван бие даасан хэмжилтийн медиан юм.
(31)-д тайлбарласны дагуу Gas1-GFP илэрхийлдэг эсүүдийг (800×107) байгалийн дархлаа тунадасжуулалтад хамруулсан. Цэвэршүүлсэн Gas1-GFP-г SDS-PAGE-ээр ялгаж, поливинилиден фтор (PVDF) мембран руу шилжүүлсэн. PVDF-г амидын хар өнгөөр ​​будах замаар уургийг дүрсэлсэн. Gas1-GFP туузыг PVDF-ээс тасдаж, метанолоор 5 удаа, шингэн хроматографийн MS (LC-MS) зэрэглэлийн усаар нэг удаа угаасан. Мембраны туузыг 500μl 0.3 M NaOAc (рН 4.0), буфер болон 500μl шинэхэн ууссан 1 M натрийн нитритийн холимогоор 37°C-д 3 цагийн турш инкубацлах замаар липидийн фракцыг Gas1-GFP-ээс ялгаруулж, лизис үүсгэдэг. Глюкозамин ба инозитолын хооронд инозин фосфатын керамидын ялгаралт үүсдэг (51). Үүний дараа мембраны туузыг LC-MS зэрэглэлийн усаар дөрвөн удаа угааж, өрөөний температурт хатааж, шинжилгээ хийх хүртэл -80°C-д азотын агаар мандалд хадгалсан. Хяналтын хувьд туршилт бүрт PVDF мембраны хоосон дээжийг ашигласан. Gas1-GFP-ээс гаргаж авсан липидийг дараа нь (50) тайлбарласны дагуу MS-ээр шинжилсэн. Товчхондоо, GPI-липид агуулсан PVDF туузыг 75μl сөрөг хөгцний уусгагч [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммонийн ацетат]-д дахин уусгаж, сфинголипидын төрөл зүйлийн электрошүрших ионжуулалт (ESI)-MRM/MS шинжилгээгээр (TSQ Vantage) давсан. Энэ тохиолдолд MS өгөгдлийг сөрөг ионы горимд авсан.
Өмнө дурдсанчлан, GPI зангууны липидийн хэсгийг [3H]-инозитолоор тэмдэглэгдсэн GPI-AP-аас (16) салгасан. Липидүүдийг уусгагч систем (55:45:10 хлороформ-метанол-0.25% KCl) ашиглан нимгэн давхаргын хроматографийн аргаар ялгаж, FLA-7000 (Fujifilm) ашиглан дүрслэн харуулсан.
Gas1-GFP (600×107) илэрхийлж буй эсүүдийг TNE буфертай TNE буфераар хоёр удаа угааж, шилэн бөмбөлгөөр хугалж, дараа нь эсийн үлдэгдэл болон шилэн бөмбөлгүүдийг зайлуулахын тулд центрифугээр хийсэн. Дараа нь дээд давхаргыг 17,000 г-д 4°C-д 1 цагийн турш центрифугээр хийсэн. Үрлэнг TNE-д угааж, 0.2% digitalis сапонин агуулсан TNE-д 1 U PI-PLC (Invitrogen)-ээр 37°C-д 1 цагийн турш инкубацласан. Ферментийн боловсруулалтын дараа мембраныг 17,000 г-д 4°C-д 1 цагийн турш центрифугээр авсан. Gas1-GFP-г дархлаа тунадасжуулахын тулд дээд давхаргыг GFP-Trap_A (ChromoTek)-ээр 4°C-д шөнийн турш инкубацалсан. SDS-PAGE-ээр ялгасан цэвэршүүлсэн Gas1-GFP-г Coomassie brilyant цэнхэр өнгөөр ​​будсан. Усны сувгийг тойрсон саарал өнгөнөөс Gas1-GFP будах туузыг тасалж, дараа нь иодоацетамидаар алкилжуулж, дитиотреитолоор бууруулсны дараа трипсинээр гель доторх задрал хийсэн. GPI-гликантай триптик пептид ба пептидийг гаргаж аваад хатаасан. Хатаасан пептидийг 20 мкл усанд уусгасан. Нэг хэсгийг (8 мкл) LC-д тарина. Тодорхой градиент нөхцөлд пептидийг ялгахад октадецилсилан (ODS) баганыг (Develosil 300ODS-HG-5; дотоод диаметр 150 мм×1.0 мм; Номура Кемикал, Айчи муж, Япон) ашигласан. Хөдөлгөөнт фаз нь уусгагч А (0.08% шоргоолжны хүчил) ба уусгагч В (80% ацетонитрилд 0.15% шоргоолжны хүчил) юм. Accela HPLC систем (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) ашиглан баганыг А уусгагчаар 55 минутын дотор 50 мкл мин-1 урсгалын хурдаар 5 минутын турш элютацид оруулж, дараа нь В уусгагчийн концентрацийг 40% хүртэл нэмэгдүүлсэн. , АНУ). Элюатыг ESI ионы эх үүсвэрт тасралтгүй нэвтрүүлж, триптик пептид ба GPI-гликантай пептидийг LTQ Orbitrap XL (эрлийз шугаман ионы хавх-орбитрап масс спектрометр; Thermo Fisher Scientific) ашиглан шинжилсэн. MS тохиргоонд капилляр эх үүсвэрийн хүчдэлийг 4.5 кВ болгож, дамжуулагч капиллярын температурыг 300°C-д байлгасан. Капилляр хүчдэл ба хоолойн линзний хүчдэлийг тус тус 15 В ба 50 В болгож тохируулсан. MS өгөгдлийг эерэг ионы горимд (нягтрал 60,000; массын нарийвчлал саяд 10 хэсэг) 300/m/z масс/цэнэгийн харьцаа (m/z) 3000 массын хүрээнд олж авсан. MS/MS өгөгдлийг LTQ Orbitrap XL [өгөгдөл хамаарах эхний 3 орон, мөргөлдөөнөөс үүдэлтэй диссоциаци (CID)] дахь ионы хавхаар дамжуулан олж авсан.
MD симуляцийг GROMACS (52) програм хангамж болон MARTINI 2 хүчний талбар (53-55) ашиглан гүйцэтгэсэн. Дараа нь CHARMM GUI мембран бүтээгчийг (56, 57) ашиглан диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) болон Cer C18 эсвэл DOPC болон Cer C26 агуулсан давхар давхаргыг бүтээсэн. Cer C26-ийн топологи болон координатыг сфингозины сүүлнээс нэмэлт бөмбөлгүүдийг салгаж DXCE-ээс гаргаж авсан. Доор тайлбарласан процессыг ашиглан давхар давхаргыг тэнцвэржүүлж, ажиллуулж, дараа нь системийн сүүлийн координатыг ашиглан Emp24 агуулсан системийг байгуулна. Мөөгөнцрийн Emp24-ийн трансмембран домэйн (үлдэгдэл 173-193) нь харааны MD (VMD) хэрэгслийн молекулын бүтцийг (58) ашиглан α-спираль хэлбэрээр байгуулагдсан. Дараа нь давхцаж буй липидийг зайлуулсны дараа уургийг бүдүүн ширхэгтэй болгож, CHARMM GUI ашиглан давхар давхаргад оруулсан. Эцсийн систем нь 1202 DOPC болон 302 Cer C26 эсвэл 1197 DOPC болон 295 Cer C18 болон Emp24 агуулдаг. Системийг 0.150M концентрацитай болтол ионжуулна. Хоёр давхаргат найрлагад зориулж дөрвөн бие даасан давталт хийсэн.
Липидийн давхаргыг CHARMM GUI процессыг ашиглан тэнцвэржүүлдэг бөгөөд энэ нь 405,000 алхамыг багасгаж, дараа нь тэнцвэржүүлэх, байрлалын хязгаарлалтыг аажмаар багасгаж, арилгаж, хугацааны алхамыг 0.005 ps-ээс 0.02 ps болгон нэмэгдүүлдэг. Тэнцвэржүүлсний дараа энэ нь 0.02 ps хугацааны алхамтай 6 µs үүсгэдэг. Emp24-ийг оруулсны дараа системийг багасгаж, тэнцвэржүүлэхийн тулд ижил CHARMM GUI процессыг ашиглана уу, дараа нь үйлдвэрлэлд 8 секундын турш ажиллана.
Бүх системийн хувьд тэнцвэржүүлэх процессын үед даралтыг Берендсен баростат (59), үйлдвэрлэлийн процессын үед даралтыг Парринелло-Рахман баростат (60) хянадаг. Бүх тохиолдолд дундаж даралт нь 1 бар бөгөөд хагас изотроп даралтын холболтын схемийг ашигладаг. Тэнцвэржүүлэлт ба үйлдвэрлэлийн процесст хурдыг дахин тохируулах термостат (61) ашиглан уураг, липид болон уусгагч хэсгүүдийн температурыг тус тусад нь холбодог. Бүхэл бүтэн ажиллагааны явцад зорилтот температур нь 310K байна. Холбоогүй харилцан үйлчлэлийг 0.005 буферийн хүлцэл бүхий Верлет схемийг ашиглан хослох жагсаалт үүсгэх замаар тооцоолно. Кулоны гишүүнийг урвалын талбар болон 1.1 нм таслах зайг ашиглан тооцоолно. Вандер Ваалсын гишүүн нь 1.1 нм таслах зайтай таслах схемийг ашигладаг бөгөөд Верлет таслах схемийг боломжит шилжилтийн үед ашигладаг (62).
VMD ашиглан DOPC фосфатын бөмбөлөг эсвэл керамид AM1 бөмбөлөг ба уургийн хоорондох таслалтын долгионы урт нь 0.7 нм бөгөөд уурагтай харилцан үйлчилдэг липидийн тоог тооцоолно. Дараах томъёоны дагуу (63)-д үзүүлсэн шиг хомсдол-баяжуулалтын (DE) коэффициентийг тооцоолно уу: DE коэффициент = (уураг дахь нийт липидийн хэмжээ 0.7) уураг дахь 0.7 (нийт липид дэх Cer-ийн хэмжээ)
Тайлагнасан утгыг дундажаар авсан бөгөөд алдааны мөрүүд нь SE-ийн дөрвөн бие даасан хуулбар юм. DE коэффициентийн статистик ач холбогдлыг t тест [(averageDE-factor-1)/SE]-ээр тооцоолно. Нэг талт тархалтаас P утгыг тооцоолно уу.
GROMACS хэрэгслийг ашиглан мөрийн сүүлийн 250 н доторх Emp24 агуулсан системийн 2 хэмжээст хажуугийн нягтралын зургийг тооцоолсон. Керамидын баяжуулалт/хомсдолын зургийг авахын тулд Cer-ийн нягтралын зургийг Cer болон DOPC-ийн газрын зургийн нийлбэрт хувааж, дараа нь бие дэх Cer-ийн концентрацид хуваана. Ижил өнгийн газрын зургийн масштабыг ашиглана.
Энэ нийтлэлийн нэмэлт материалыг http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 хаягаар орж үзнэ үү.
Энэ бол Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ийн нөхцлийн дагуу тараасан нээлттэй хандалттай нийтлэл бөгөөд эцсийн хэрэглээ нь арилжааны ашиг олох зорилгоор биш бөгөөд анхны бүтээл зөв байх ёстой гэсэн үндэслэл бүхий аливаа хэрэгслээр ашиглах, түгээх, хуулбарлахыг зөвшөөрдөг. Лавлагаа.
Тэмдэглэл: Бид танаас зөвхөн имэйл хаягаа өгөхийг хүсэж байгаа бөгөөд ингэснээр таны хуудсанд санал болгож буй хүн та имэйлийг харахыг хүсч байгаа бөгөөд энэ нь спам биш гэдгийг мэдэх болно. Бид ямар ч имэйл хаягийг авахгүй.
Энэ асуултыг та зочин эсэхийг шалгах, мөн автоматаар спам илгээхээс урьдчилан сэргийлэхэд ашигладаг.
София Родригес-Гальярдо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валериа Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Мариа Перезер (Л. Сергие) Лопез), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D өндөр нягтралтай бодит цагийн дүрслэл нь сонгомол гаралтын цэгүүдэд уургийг ялгахад керамидын гинжин хэлхээний уртын ач холбогдлыг харуулж байна.
София Родригес-Гальярдо, Казуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомез (Алехандро Кортес-Гомез), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валериа Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Мариа Перезер (Л. Сергие) Лопез), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D өндөр нягтралтай бодит цагийн дүрслэл нь сонгомол гаралтын цэгүүдэд уургийг ялгахад керамидын гинжин хэлхээний уртын ач холбогдлыг харуулж байна.
©2020 Америкийн шинжлэх ухааны дэвшлийн нийгэмлэг. бүх эрх хуулиар хамгаалагдсан. AAAS нь HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER хамтлагуудын түнш юм. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.