Бид өмнө нь элэгний фиброзтой өвчтөнүүдэд гэдэснээс гаралтай триптофаны метаболит индол-3-пропионы хүчил (IPA)-ийн сийвэнгийн түвшин бага байгааг мэдээлсэн. Энэхүү судалгаанд бид таргалалттай элэгний транскриптом ба ДНХ-ийн метиломыг сийвэнгийн IPA-ийн түвшинтэй холбон судалж, мөн in vitro нөхцөлд элэгний од эсийн (HSCs) фенотипийн идэвхгүйжүүлэлтийг өдөөхөд IPA-ийн үүргийг судалсан.
Судалгаанд Куопиогийн Бариатрик мэс заслын төвд (KOBS) бариатрик мэс засал хийлгэсэн 2-р хэлбэрийн чихрийн шижин (T2DM)-гүй 116 таргалалттай өвчтөн (46.8 ± 9.3 нас; БЖИ: 42.7 ± 5.0 кг/м²) хамрагдсан. Цусны эргэлтийн IPA-ийн түвшинг шингэн хроматографи-масс спектрометрээр (LC-MS) хэмжиж, элэгний транскриптомын шинжилгээг нийт РНХ-ийн дарааллаар, ДНХ-ийн метилжилтийн шинжилгээг Infinium HumanMethylation450 BeadChip ашиглан хийсэн. Хүний элэгний од хэлбэртэй эсүүдийг (LX-2) in vitro туршилтанд ашигласан.
Сийвэн дэх IPA түвшин нь элэгний апоптоз, митофагик болон урт наслалтын замд оролцдог генийн илэрхийлэлтэй хамааралтай байв. AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) ген нь элэгний транскрипт болон ДНХ-ийн метилжилтийн профайлд хамгийн элбэг бөгөөд давамгайлсан харилцан үйлчлэлцдэг ген байв. IPA эмчилгээ нь фиброз, апоптоз, LX-2 эсийн амьд үлдэх чадварыг зохицуулдаг генийн илэрхийлэлийг өөрчлөх замаар апоптозыг өдөөж, митохондрийн амьсгалыг бууруулж, эсийн морфологи, митохондрийн динамикийг өөрчилсөн.
Эдгээр өгөгдөл нь IPA нь эмчилгээний үр нөлөөтэй бөгөөд апоптозыг өдөөж, HSC фенотипийг идэвхгүй төлөв рүү шилжүүлж, улмаар HSC-ийн идэвхжил болон митохондрийн солилцоонд саад учруулснаар элэгний фиброзыг дарангуйлах боломжийг өргөжүүлж болохыг баталж байна.
Таргалалт болон бодисын солилцооны хам шинжийн тархалт нь бодисын солилцоотой холбоотой өөхлөлтийн элэгний өвчин (MASLD)-ийн тохиолдол нэмэгдэж байгаатай холбоотой; энэ өвчин нь нийт хүн амын 25-30%-д нөлөөлдөг [1]. MASLD-ийн шалтгаант гол үр дагавар нь элэгний фиброз бөгөөд энэ нь эсийн гаднах матриц (ECM) тасралтгүй хуримтлагдах замаар тодорхойлогддог динамик үйл явц юм [2]. Элэгний фиброзд оролцдог гол эсүүд нь элэгний од хэлбэртэй эсүүд (HSCs) бөгөөд эдгээр нь мэдэгдэж буй дөрвөн фенотипийг харуулдаг: тайван, идэвхжүүлсэн, идэвхгүйжүүлсэн, хөгширсөн [3, 4]. HSCs нь идэвхжиж, тайван хэлбэрээс өндөр энерги шаарддаг пролифератив фибробласт төст эсүүд рүү шилжиж, α-гөлгөр булчингийн актин (α-SMA) болон I хэлбэрийн коллагены (Col-I) экспрессийг нэмэгдүүлдэг [5, 6]. Элэгний фиброзын эргэлтийн үед идэвхжүүлсэн HSCs нь апоптоз эсвэл идэвхгүйжүүлэлтээр арилдаг. Эдгээр үйл явцад фиброгенийн генийн бууралт болон амьд үлдэх генийн модуляци (NF-κB болон PI3K/Akt дохиоллын зам гэх мэт) [7, 8], мөн митохондрийн динамик ба үйл ажиллагааны өөрчлөлтүүд [9] орно.
Гэдэс дотор үүсдэг триптофаны метаболит индол-3-пропионы хүчил (IPA)-ийн сийвэн дэх түвшин нь MASLD зэрэг хүний ​​бодисын солилцооны өвчний үед буурсан болохыг тогтоосон [10-13]. IPA нь хоолны эслэгийн хэрэглээтэй холбоотой, антиоксидант болон үрэвслийн эсрэг үйлчилгээтэй гэдгээрээ алдартай бөгөөд хоолны дэглэмээс үүдэлтэй согтууруулах бус стеатогепатит (NASH) фенотипийг in vivo болон in vitro [11-14] бууруулдаг. Куопиогийн бариатик мэс заслын судалгаанд (KOBS) элэгний фиброзтой өвчтөнүүдийн сийвэн дэх IPA-ийн түвшин элэгний фиброзгүй таргалалттай өвчтөнүүдтэй харьцуулахад бага байгааг харуулсан бидний өмнөх судалгаанаас зарим нотолгоо гарч ирсэн. Цаашилбал, IPA эмчилгээ нь хүний ​​элэгний од хэлбэртэй эс (LX-2) загварт эсийн наалдац, эсийн шилжилт хөдөлгөөн, гематопоэтик үүдэл эсийн идэвхжлийн сонгодог маркер болох генийн экспрессийг бууруулж, элэг хамгаалах боломжтой метаболит болохыг харуулсан [15]. Гэсэн хэдий ч IPA нь HSC апоптоз болон митохондрийн биоэнергетикийг идэвхжүүлснээр элэгний фиброзын регрессийг хэрхэн өдөөдөг нь тодорхойгүй хэвээр байна.
Энд бид сийвэнгийн IPA нь таргалалттай боловч 2-р хэлбэрийн чихрийн шижин (KOBS)-гүй хүмүүсийн элгэнд апоптоз, митофаги болон урт наслалтын замд баяжуулсан генийн экспресстэй холбоотой болохыг харуулж байна. Цаашилбал, IPA нь идэвхжсэн гематопоэтик үүдэл эсийн (HSCs) идэвхгүйжүүлэх замаар цэвэршилт болон задралыг өдөөж чаддаг болохыг бид тогтоосон. Эдгээр үр дүнгүүд нь IPA-ийн шинэ үүргийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь элэгний фиброзын регрессийг дэмжих эмчилгээний зорилтот түвшин болгож байна.
KOBS когорт судалгаанд өмнөх судалгаагаар элэгний фиброзтой өвчтөнүүдийн цусны эргэлтийн IPA түвшин элэгний фиброзгүй өвчтөнүүдтэй харьцуулахад бага байгааг харуулсан [15]. 2-р хэлбэрийн чихрийн шижингийн болзошгүй төөрөгдүүлэх нөлөөг хасахын тулд бид KOBS судалгаанаас 2-р хэлбэрийн чихрийн шижингүй 116 таргалалттай өвчтөнийг (дундаж нас ± SD: 46.8 ± 9.3 жил; BMI: 42.7 ± 5.0 кг/м2) (Хүснэгт 1) судалгааны популяци болгон сонгосон [16]. Бүх оролцогчид бичгээр мэдээлэл өгсөн зөвшөөрөл өгсөн бөгөөд судалгааны протоколыг Хельсинкийн тунхаглалын (54/2005, 104/2008 болон 27/2010) дагуу Хойд Саво гүнлигийн эмнэлгийн ёс зүйн хороо баталсан.
Элэгний биопсийн дээжийг бариатрик мэс заслын үед авч, өмнө нь тайлбарласан шалгуурын дагуу туршлагатай эмгэг судлаачид гистологийн шинжилгээгээр үнэлсэн [17, 18]. Үнэлгээний шалгуурыг Нэмэлт Хүснэгт S1-д нэгтгэн дүгнэсэн бөгөөд өмнө нь тайлбарласан [19].
Мацаг барих сийвэнгийн дээжийг метаболомик шинжилгээнд зориулан зорилтот бус шингэн хроматографи-масс спектрометр (LC-MS) ашиглан шинжилсэн (n = 116). Дээжийг өмнө нь тайлбарласны дагуу UHPLC-qTOF-MS систем (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Герман) ашиглан шинжилсэн. Изопропилийн спиртийг (IPA) тодорхойлох нь хадгалах хугацаа болон MS/MS спектрийг цэвэр стандарттай харьцуулах дээр үндэслэсэн. IPA дохионы эрчим (оргил бүс)-ийг цаашдын бүх шинжилгээнд авч үзсэн [20].
Элэгний бүхэл РНХ-ийн дарааллыг Illumina HiSeq 2500 ашиглан хийсэн бөгөөд өгөгдлийг өмнө нь тайлбарласны дагуу урьдчилан боловсруулсан [19, 21, 22]. Бид MitoMiner 4.0 мэдээллийн сангаас сонгосон 1957 генийг ашиглан митохондрийн үйл ажиллагаа/биогенезид нөлөөлдөг транскрипцийн зорилтот дифференциал экспрессийн шинжилгээг хийсэн [23]. Элэгний ДНХ-ийн метилжилтийн шинжилгээг өмнө нь тайлбарласантай ижил аргачлалыг ашиглан Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан Диего, Калифорни, АНУ) ашиглан хийсэн [24, 25].
Хүний элэгний од хэлбэртэй эсүүдийг (LX-2) профессор Стефано Ромео эелдэгээр хангаж, DMEM/F12 орчинд (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) өсгөвөрлөж, хадгалсан. IPA-ийн ажлын тунг сонгохын тулд LX-2 эсүүдийг DMEM/F12 орчинд 24 цагийн турш IPA-ийн өөр өөр концентрацитай (10 μM, 100 μM ба 1 mM; Sigma, 220027) IPA-аар эмчилсэн. Цаашилбал, IPA-ийн HSC-ийг идэвхгүйжүүлэх чадварыг судлахын тулд LX-2 эсүүдийг 5 нг/мл TGF-β1 (R&D систем, 240-B-002/CF) болон 1 mM IPA-аар ийлдэсгүй орчинд 24 цагийн турш хамт эмчилсэн. Харгалзах тээврийн хэрэгслийн хяналтын хувьд TGF-β1 эмчилгээнд 0.1% BSA агуулсан 4 нМ HCL, IPA эмчилгээнд 0.05% DMSO ашигласан бөгөөд хоёуланг нь хавсарсан эмчилгээнд хамт хэрэглэсэн.
Апоптозыг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу FITC Annexin V апоптоз илрүүлэх хэрэгсэл (7-AAD бүхий Biologend, Сан Диего, Калифорни, АНУ, Cat# 640922) ашиглан үнэлсэн. Товчхондоо, LX-2 (1 × 105 эс/худаг)-ийг 12 худагтай хавтан дээр шөнийн турш өсгөвөрлөж, дараа нь IPA эсвэл IPA болон TGF-β1-ийн олон тунгаар боловсруулсан. Дараагийн өдөр нь хөвөгч болон наалдсан эсүүдийг цуглуулж, трипсинжүүлж, PBS-ээр угааж, Annexin V холбох буферт дахин суспенз хийж, FITC-Annexin V болон 7-AAD-тай 15 минутын турш инкубацлав.
Амьд эсийн митохондрийг Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорни) ашиглан исэлдэлтийн идэвхжилд будсан. MTR шинжилгээний хувьд LX-2 эсийг IPA болон TGF-β1-тэй тэнцүү нягтралтайгаар инкубацлав. 24 цагийн дараа амьд эсийг трипсинжүүлж, PBS-ээр угааж, дараа нь өмнө нь тайлбарласны дагуу [26] 37°C-д 20 минутын турш ийлдэсгүй орчинд 100 μM MTR-ээр инкубацлав. Амьд эсийн морфологийн шинжилгээнд эсийн хэмжээ болон цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдлыг тус тус урагш тархалт (FSC) болон хажуугийн тархалт (SSC) параметрүүдийг ашиглан шинжилсэн.
Бүх өгөгдлийг (30,000 үйл явдал) NovoCyte Quanteon (Agilent) ашиглан цуглуулж, NovoExpress® 1.4.1 эсвэл FlowJo V.10 програм хангамж ашиглан шинжилсэн.
Хүчилтөрөгчийн хэрэглээний хурд (OCR) болон эсийн гаднах хүчиллэгжилтийн хурдыг (ECAR) үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу Seahorse XF Cell Mito Stress-ээр тоноглогдсон Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ашиглан бодит цаг хугацаанд хэмжсэн. Товчхондоо, 2 × 104 LX-2 эс/худагийг XF96 эсийн өсгөвөрийн хавтан дээр суулгасан. Шөнийн турш инкубацийн дараа эсүүдийг изопропанол (IPA) болон TGF-β1-ээр боловсруулсан (Нэмэлт аргууд 1). Өгөгдлийн шинжилгээг Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator-ийг багтаасан Seahorse XF Wave програм хангамж ашиглан хийсэн. Үүнээс үндэслэн Биоэнергетик Эрүүл Мэндийн Индекс (BHI)-ийг тооцоолсон [27].
Нийт РНХ-г кДНХ болгон транскрипц хийсэн. Тодорхой аргуудын талаар [15] лавлагаанаас үзнэ үү. Хүний 60S рибосомын хүчиллэг уураг P0 (RPLP0) болон циклофилин A1 (PPIA) мРНХ-ийн түвшинг генийн үндсэн хяналт болгон ашигласан. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR системийг (Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерланд) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) эсвэл Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050)-тай хамт ашигласан бөгөөд харьцангуй генийн экспрессийн нугалалтыг харьцуулсан Ct утгын мөчлөгийн параметрүүд (ΔΔCt) болон ∆∆Ct аргыг ашиглан тооцоолсон. Праймеруудын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг S2 ба S3 нэмэлт хүснэгтэд өгсөн болно.
Цөмийн ДНХ (ncDNA) болон митохондрийн ДНХ (mtDNA)-г өмнө нь тайлбарласны дагуу [28] DNeasy цус болон эдийн хэрэгсэл (Qiagen) ашиглан гаргаж авсан. mtDNA-ийн харьцангуй хэмжээг Нэмэлт аргууд 2-т дэлгэрэнгүй тайлбарласны дагуу зорилтот mtDNA бүс тус бүрийн цөмийн ДНХ-ийн гурван бүсийн геометрийн дундаж (mtDNA/ncDNA)-тай харьцуулсан харьцааг тооцоолж тооцоолсон. mtDNA болон ncDNA-ийн праймеруудын дэлгэрэнгүй мэдээллийг Нэмэлт хүснэгт S4-т үзүүлэв.
Амьд эсүүдийг эс хоорондын болон эсийн доторх митохондрийн сүлжээг харахын тулд Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорни)-аар будсан. LX-2 эсүүдийг (1 × 104 эс/худаг) шилэн слайд дээр харгалзах шилэн ёроолтой өсгөврийн хавтан дээр (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Герман) өсгөвөрлөв. 24 цагийн дараа амьд LX-2 эсийг 37 °C-д 20 минутын турш 100 μM MTR-ээр өсгөвөрлөж, эсийн цөмийг өмнө нь тайлбарласны дагуу DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich)-аар будсан [29]. Митохондрийн сүлжээг 37 °C-д 5% CO2-той чийгшүүлсэн агаар мандалд Zeiss LSM 800 конфокал модулиар тоноглогдсон Zeiss Axio Observer урвуу микроскоп (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Герман) ашиглан 63×NA 1.3 объектив ашиглан харсан. Бид дээжийн төрөл тус бүрт арван Z цувралын зураг авсан. Z цуврал бүр нь 9.86 μм зузаантай 30 хэсэгтэй. Дээж бүрийн хувьд ZEN 2009 програм хангамж (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Жена, Герман) ашиглан арван өөр харах талбайн зургийг авсан бөгөөд Нэмэлт аргууд 3-т дэлгэрэнгүй заасан параметрүүдийн дагуу ImageJ програм хангамж (v1.54d) [30, 31] ашиглан митохондрийн морфологийн шинжилгээг хийсэн.
Эсүүдийг 0.1 М фосфатын буферт 2% глутаральдегидээр бэхлээд, дараа нь 1% осмийн тетроксидын уусмалаар (Sigma Aldrich, MO, АНУ) бэхлээд, ацетоноор аажмаар хатааж (Merck, Darmstadt, Герман), эцэст нь эпокси давирхайд суулгасан. Хэт нимгэн хэсгүүдийг бэлтгэж, 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Герман) болон 1% хар тугалганы цитратаар (Merck, Darmstadt, Герман) будсан. Хэт бүтцийн зургийг 80 кВ-ын хурдасгуур хүчдэл дээр JEM 2100F EXII дамжуулалтын электрон микроскоп (JEOL Ltd, Токио, Япон) ашиглан авсан.
IPA-аар 24 цагийн турш эмчилсэн LX-2 эсийн морфологийг Zeiss урвуу гэрлийн микроскоп (Zeiss Axio Vert.A1 болон AxioCam MRm, Йена, Герман) ашиглан 50 дахин томруулалттай фазын тодосгогч микроскопоор шинжилсэн.
Эмнэлзүйн өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлт эсвэл медиан (квартил хоорондын хүрээ: IQR) гэж илэрхийлсэн. Гурван судалгааны бүлгийн хоорондох ялгааг харьцуулахын тулд дисперсийн нэг талын шинжилгээ (тасралтгүй хувьсагч) эсвэл χ² тест (ангиллын хувьсагч)-ийг ашигласан. Олон удаагийн шинжилгээг залруулахын тулд хуурамч эерэг хувь (FDR)-ийг ашигласан бөгөөд FDR < 0.05 бүхий генүүдийг статистикийн хувьд ач холбогдолтой гэж үзсэн. CpG ДНХ-ийн метилжилтийг IPA дохионы эрчимтэй холбохын тулд Спирманы корреляцийн шинжилгээг ашигласан бөгөөд нэрлэсэн p утгыг (p < 0.05) мэдээлсэн.
Сийвэн дэх IPA-ийн түвшинтэй холбоотой 268 транскрипт (нэрлэсэн p < 0.01), митохондритай холбоотой 119 транскрипт (нэрлэсэн p < 0.05), элэгний 3093 транскриптээс 4350 CpG-д зориулсан вэбд суурилсан генийн багцын шинжилгээний хэрэгсэл (WebGestalt) ашиглан замын шинжилгээг хийсэн. Давхардсан генийг олоход чөлөөтэй байдаг Venny DB (2.1.0 хувилбар) хэрэгслийг, уураг-уургийн харилцан үйлчлэлийг дүрслэхэд StringDB (11.5 хувилбар)-ийг ашигласан.
LX-2 туршилтын хувьд дээжийг Д'Агостино-Пирсоны тестийг ашиглан хэвийн эсэхийг шалгасан. Өгөгдлийг дор хаяж гурван биологийн давталтаас авч, Бонферронигийн пост-хок тестийн хамт нэг талын ANOVA-д хамруулсан. 0.05-аас бага p-утгыг статистикийн хувьд ач холбогдолтой гэж үзсэн. Өгөгдлийг дундаж ± SD гэж үзүүлсэн бөгөөд туршилтын тоог зураг бүрт харуулав. Бүх шинжилгээ болон графикийг Windows-д зориулсан GraphPad Prism 8 статистикийн програм хангамж (GraphPad Software Inc., 8.4.3 хувилбар, Сан Диего, АНУ) ашиглан гүйцэтгэсэн.
Эхлээд бид сийвэнгийн IPA түвшин нь элэг, бүх биеийн болон митохондрийн транскрипттэй хэрхэн холбогдож байгааг судалсан. Нийт транскриптийн профайлд сийвэнгийн IPA түвшинтэй холбоотой хамгийн хүчтэй ген нь MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; митогенээр идэвхжүүлсэн уураг киназагаар идэвхжүүлсэн уураг киназа 3); митохондритой холбоотой транскриптийн профайлд хамгийн хүчтэй холбоотой ген нь AKT1 (FDR = 0.7621; AKT серин/треонин киназа 1) байсан (Нэмэлт файл 1 ба Нэмэлт файл 2).
Дараа нь бид дэлхийн транскриптүүд (n = 268; p < 0.01) болон митохондритой холбоотой транскриптүүдийг (n = 119; p < 0.05) шинжилж, эцэст нь апоптозыг хамгийн чухал каноник зам гэж тодорхойлсон (p = 0.0089). Сийвэнгийн IPA түвшинтэй холбоотой митохондрийн транскриптүүдийн хувьд бид апоптоз (FDR = 0.00001), митофаги (FDR = 0.00029) болон TNF дохиоллын замууд (FDR = 0.000006) дээр анхаарлаа төвлөрүүлсэн (Зураг 1A, Хүснэгт 2, Нэмэлт зураг 1A-B).
Сийвэн дэх IPA түвшинтэй холбоотой дэлхийн, митохондритой холбоотой транскрипт болон хүний ​​элэгний ДНХ-ийн метилжилтийн давхцсан шинжилгээ. А нь сийвэн дэх IPA түвшинтэй холбоотой 3092 CpG цэгүүдтэй холбогдсон 268 дэлхийн транскрипт, 119 митохондритой холбоотой транскрипт, ДНХ-ийн метилжүүлсэн транскриптийг илэрхийлнэ (дэлхийн транскрипт ба ДНХ-ийн метилжүүлсэн транскриптүүдийн хувьд p утга < 0.01, митохондриалын транскриптүүдийн хувьд p утга < 0.05). Гол давхцсан транскриптүүдийг дунд хэсэгт харуулав (AKT1 ба YKT6). B Хамгийн өндөр харилцан үйлчлэлийн оноотой (0.900) 13 генийн бусад генүүдтэй харилцан үйлчлэлийн зургийг StringDB онлайн хэрэгслийг ашиглан сийвэн дэх IPA түвшинтэй мэдэгдэхүйц холбоотой 56 давхцсан генээс (хар шугамын бүс) бүтээв. Ногоон: Генийн онтологи (GO) эсийн бүрэлдэхүүн хэсэг болох митохондри (GO:0005739)-д зурагласан генүүд. AKT1 нь өгөгдөлд (текст олборлолт, туршилт, мэдээллийн сан, хамтын илэрхийлэл дээр үндэслэн) үндэслэн бусад уургуудтай харилцан үйлчлэлийн хувьд хамгийн өндөр оноотой (0.900) уураг юм. Сүлжээний зангилаа нь уургуудыг, ирмэгүүд нь уургуудын хоорондох холболтыг илэрхийлдэг.
Гэдэсний микробиотын метаболитууд нь ДНХ-ийн метилжилтээр дамжуулан эпигенетикийн найрлагыг зохицуулж чаддаг тул [32] бид сийвэнгийн IPA-ийн түвшин элэгний ДНХ-ийн метилжилттэй холбоотой эсэхийг судалсан. Бид сийвэнгийн IPA-ийн түвшинтэй холбоотой хоёр гол метилжилтийн цэг нь пролин-серины баялаг бүс 3 (C19orf55) болон дулааны шокын уургийн бүлгийн В (жижиг) гишүүн 6 (HSPB6) ойролцоо байгааг тогтоосон (Нэмэлт файл 3). 4350 CpG-ийн ДНХ-ийн метилжилт (p < 0.01) нь сийвэнгийн IPA-ийн түвшинтэй хамааралтай байсан бөгөөд урт наслалтын зохицуулалтын замуудаар баяжсан (p = 0.006) (Зураг 1A, Хүснэгт 2, Нэмэлт Зураг 1C).
Хүний элэгний сийвэн дэх IPA түвшин, дэлхийн транскрипт, митохондритой холбоотой транскрипт, ДНХ-ийн метилжилтийн хоорондын холбоог ойлгохын тулд бид өмнөх замын шинжилгээнд тодорхойлсон генүүдийн давхцлын шинжилгээг хийсэн (Зураг 1A). 56 давхцсан генийн замын баяжуулалтын шинжилгээний үр дүнгээс харахад (Зураг 1A-д хар шугамын дотор) апоптозын зам (p = 0.00029) нь гурван шинжилгээнд нийтлэг хоёр генийг тодруулсан: AKT1 ба YKT6 (YKT6 v-SNARE гомолог), Венн диаграммд үзүүлсэн шиг (Нэмэлт Зураг 2 ба Зураг 1A). Сонирхолтой нь, бид AKT1 (cg19831386) ба YKT6 (cg24161647) нь сийвэн дэх IPA түвшинтэй эерэг хамааралтай болохыг тогтоосон (Нэмэлт файл 3). Генийн бүтээгдэхүүний хоорондох уургийн харилцан үйлчлэлийн болзошгүй байдлыг тодорхойлохын тулд бид 56 давхцсан генээс хамгийн өндөр нийтлэг бүсийн оноо (0.900) бүхий 13 генийг оролт болгон сонгож, харилцан үйлчлэлийн газрын зургийг бүтээсэн. Итгэлцлийн түвшингээр (ахиу итгэлцэл) хамгийн өндөр оноотой (0.900) AKT1 ген дээд байранд байсан (Зураг 1B).
Замын шинжилгээнд үндэслэн бид апоптоз нь гол зам болохыг тогтоосон тул IPA эмчилгээ нь HSC-ийн апоптозд нөлөөлөх эсэхийг in vitro судалж үзсэн. Бид өмнө нь IPA-ийн өөр өөр тун (10 μM, 100 μM, ба 1 mM) нь LX-2 эсүүдэд хоргүй болохыг харуулсан [15]. Энэхүү судалгаагаар 10 μM ба 100 μM-д IPA эмчилгээ хийх нь амьдрах чадвартай болон үхжилтэй эсийн тоог нэмэгдүүлсэн болохыг харуулсан. Гэсэн хэдий ч хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад эсийн амьдрах чадвар 1 mM IPA концентрацид буурсан бол эсийн үхжилийн хурд өөрчлөгдөөгүй хэвээр байна (Зураг 2A, B). Дараа нь LX-2 эсүүдэд апоптозыг өдөөх оновчтой концентрацийг олохын тулд бид 10 μM, 100 μM, ба 1 mM IPA-г 24 цагийн турш туршсан (Зураг 2A-E болон Нэмэлт Зураг 3A-B). Сонирхолтой нь, IPA 10 μM ба 100 μM нь апоптозын түвшинг (%) бууруулсан боловч IPA 1 mM нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хожуу апоптоз болон апоптозын түвшинг (%) нэмэгдүүлсэн тул цаашдын туршилтад сонгосон (Зураг 2A–D).
IPA нь LX-2 эсийн апоптозыг өдөөдөг. Аннексин V болон 7-AAD давхар будалтын аргыг урсгалын цитометрээр апоптозын хурд болон эсийн морфологийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлоход ашигласан. BA эсүүдийг 10 μM, 100 μM болон 1 mM IPA-аар 24 цагийн турш эсвэл F–H TGF-β1 (5 нг/мл) болон 1 mM IPA-аар ийлдэсгүй орчинд 24 цагийн турш инкубацлав. A: амьд эсүүд (Annexin V -/ 7AAD-); B: үхжилтэй эсүүд (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: эрт (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: хожуу (Annexin V+/7AAD.+); E, H: нийт эрт ба хожуу апоптозын эсийн апоптозын хурд дахь хувь (%). Өгөгдлийг дундаж ± SD, n = 3 бие даасан туршилтаар илэрхийлнэ. Статистикийн харьцуулалтыг нэг талын ANOVA болон Бонферронигийн пост-хок тестийг ашиглан хийсэн. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Өмнө нь харуулсанчлан, 5 нг/мл TGF-β1 нь сонгодог маркер генийн экспрессийг нэмэгдүүлэх замаар HSC идэвхжлийг өдөөж чаддаг [15]. LX-2 эсүүдийг 5 нг/мл TGF-β1 болон 1 мМ IPA-аар хавсарч эмчилсэн (Зураг 2E–H). TGF-β1 эмчилгээ нь апоптозын түвшинг өөрчлөөгүй боловч IPA-тай хавсарсан эмчилгээ нь TGF-β1 эмчилгээтэй харьцуулахад хожуу апоптоз болон апоптозын түвшинг (%) нэмэгдүүлсэн (Зураг 2E–H). Эдгээр үр дүнгээс харахад 1 мМ IPA нь TGF-β1 индукцээс үл хамааран LX-2 эсүүдэд апоптозыг дэмжиж чадна.
Бид LX-2 эсүүдэд IPA-ийн митохондрийн амьсгалд үзүүлэх нөлөөг цаашид судалсан. Үр дүнгээс харахад 1 мМ IPA нь хүчилтөрөгчийн хэрэглээний хурд (OCR)-ийн параметрүүдийг бууруулсан: митохондрийн бус амьсгал, суурь ба хамгийн их амьсгал, протоны алдагдал болон ATP үйлдвэрлэлийг хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад (Зураг 3A, B), харин биоэнергетик эрүүл мэндийн индекс (BHI) өөрчлөгдөөгүй байна.
IPA нь LX-2 эсүүдэд митохондрийн амьсгалыг бууруулдаг. Митохондрийн амьсгалын муруй (OCR)-ийг митохондрийн амьсгалын параметрүүд (митохондрийн бус амьсгал, суурь амьсгал, хамгийн их амьсгал, протоны алдагдал, ATP үүсэх, SRC ба BHI) хэлбэрээр үзүүлэв. А ба В эсүүдийг тус тус 10 μM, 100 μM ба 1 mM IPA-аар 24 цагийн турш инкубацлав. С ба D эсүүдийг ийлдэсгүй орчинд TGF-β1 (5 нг/мл) ба 1 mM IPA-аар тус тус 24 цагийн турш инкубацлав. Бүх хэмжилтийг CyQuant иж бүрдлийг ашиглан ДНХ-ийн агууламжтай хэвийн болгосон. BHI: биоэнергетик эрүүл мэндийн индекс; SRC: амьсгалын нөөцийн багтаамж; OCR: хүчилтөрөгчийн хэрэглээний хурд. Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлт (SD), n = 5 бие даасан туршилтаар үзүүлэв. Статистик харьцуулалтыг нэг талын ANOVA болон Bonferroni post hoc тест ашиглан хийсэн. *p < 0.05; **p < 0.01; ба ***p < 0.001
TGF-β1-идэвхжүүлсэн LX-2 эсийн биоэнергетик профайлд IPA-ийн нөлөөллийн талаар илүү цогц ойлголт авахын тулд бид OCR-ээр митохондрийн исэлдэлтийн фосфоржилтыг шинжилсэн (Зураг 3C, D). Үр дүнгээс харахад TGF-β1 эмчилгээ нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хамгийн их амьсгал, амьсгалын нөөцийн багтаамж (SRC) болон BHI-г бууруулж чадна (Зураг 3C, D). Үүнээс гадна, хавсарсан эмчилгээ нь суурь амьсгал, протоны алдагдал болон ATP үйлдвэрлэлийг бууруулсан боловч SRC болон BHI нь TGF-β1-ээр эмчилсэнээс мэдэгдэхүйц өндөр байв (Зураг 3C, D).
Бид мөн Seahorse програм хангамжийн өгсөн "Эсийн энергийн фенотипийн тест"-ийг хийсэн (Нэмэлт зураг 4A–D). Нэмэлт зураг 3B-д үзүүлсэнчлэн TGF-β1 эмчилгээний дараа OCR болон ECAR бодисын солилцооны потенциал хоёулаа буурсан боловч хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хавсарсан болон IPA эмчилгээний бүлгүүдэд ялгаа ажиглагдаагүй. Цаашилбал, хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хавсарсан болон IPA эмчилгээний дараа OCR-ийн суурь болон стрессийн түвшин буурсан (Нэмэлт зураг 4C). Сонирхолтой нь, хавсарсан эмчилгээний үед ижил төстэй хэв маяг ажиглагдсан бөгөөд TGF-β1 эмчилгээтэй харьцуулахад ECAR-ийн суурь болон стрессийн түвшинд өөрчлөлт ажиглагдаагүй (Нэмэлт зураг 4C). HSC-д митохондрийн исэлдэлтийн фосфоржилт буурч, TGF-β1 эмчилгээнд өртсөний дараа хавсарсан эмчилгээний SCR болон BHI-г сэргээх чадвар нь бодисын солилцооны потенциалд өөрчлөлт оруулаагүй (OCR болон ECAR). Эдгээр үр дүнгүүдийг нэгтгэн үзвэл IPA нь HSC-ийн биоэнергийг бууруулж болзошгүйг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь IPA нь HSC фенотипийг идэвхгүйжүүлэх чиглэлд шилжүүлдэг бага энергийн профайлыг өдөөж болохыг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 4D).
Митохондрийн динамикт IPA-ийн нөлөөг митохондрийн морфологи болон сүлжээний холболтын гурван хэмжээст тоон үзүүлэлт, мөн MTR будалт ашиглан судалсан (Зураг 4 ба Нэмэлт Зураг 5). Зураг 4-т хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад TGF-β1 эмчилгээ нь дундаж гадаргуугийн талбай, мөчрийн тоо, нийт мөчрийн урт, мөчрийн уулзварын тоог бууруулж (Зураг 4A ба B), митохондрийн эзлэх хувийг бөмбөрцөг хэлбэрээс завсрын хэлбэрт шилжүүлсэн болохыг харуулсан (Зураг 4C). Зөвхөн IPA эмчилгээ нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад митохондрийн дундаж эзэлхүүнийг бууруулж, митохондрийн эзлэх хувийг бөмбөрцөг хэлбэрээс завсрын хэлбэрт шилжүүлсэн (Зураг 4A). Үүний эсрэгээр, митохондрийн мембраны потенциалаас хамааралтай MTR-ээр үнэлэгдсэн бөмбөрцөг хэлбэр, дундаж мөчрийн урт, митохондрийн идэвхжил (Зураг 4A ба E) өөрчлөгдөөгүй бөгөөд эдгээр параметрүүд бүлгүүдийн хооронд ялгаагүй байв. Эдгээр үр дүнгүүдийг нэгтгэн авч үзвэл TGF-β1 ба IPA эмчилгээ нь амьд LX-2 эсүүдэд митохондрийн хэлбэр, хэмжээг, мөн сүлжээний нарийн төвөгтэй байдлыг зохицуулдаг болохыг харуулж байна.
IPA нь LX-2 эсүүдэд митохондрийн динамик болон митохондрийн ДНХ-ийн элбэгшлийг өөрчилдөг. A. Сийвэнгүй орчинд TGF-β1 (5 нг/мл) болон 1 мМ IPA-аар 24 цагийн турш инкубацлагдсан амьд LX-2 эсийн төлөөллийн конфокал зургууд нь Mitotracker™ Red CMXRos-оор будсан митохондрийн сүлжээ, DAPI-ээр цэнхэр өнгөөр ​​будсан цөмүүдийг харуулсан. Бүх өгөгдөл нь бүлэг тус бүрээс дор хаяж 15 зураг агуулсан. Бид дээжийн төрөл тус бүрт 10 Z-стек зураг авсан. Z тэнхлэгийн дараалал бүр нь 9.86 μм зузаантай 30 зүсмэл агуулсан. Хуваарийн мөр: 10 μм. B. Зурагт дасан зохицох босго хэмжээг хэрэглэснээр тодорхойлогдсон төлөөллийн объектууд (зөвхөн митохондри). Бүлэг бүрийн бүх эсүүдэд митохондрийн морфологийн сүлжээний холболтын тоон шинжилгээ, харьцуулалтыг хийсэн. C. Митохондрийн хэлбэрийн харьцааны давтамж. 0-тэй ойролцоо утга нь бөмбөрцөг хэлбэртэй, 1-тэй ойролцоо утга нь утаслаг хэлбэртэй байгааг илтгэнэ. D Митохондрийн ДНХ (mtDNA)-ийн агууламжийг Материал ба Арга зүйд тайлбарласны дагуу тодорхойлсон. E Mitotracker™ Red CMXRos шинжилгээг Материал ба Арга зүйд тайлбарласны дагуу урсгалын цитометрээр (30,000 үйл явдал) гүйцэтгэсэн. Өгөгдлийг дундаж ± SD, n = 3 бие даасан туршилтаар үзүүлэв. Статистикийн харьцуулалтыг нэг талын ANOVA болон Bonferroni post hoc тест ашиглан хийсэн. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Дараа нь бид LX-2 эсүүд дэх мтДНХ-ийн агууламжийг митохондрийн тооны индикатор болгон шинжилсэн. Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад TGF-β1-ээр эмчилсэн бүлэгт мтДНХ-ийн агууламж нэмэгдсэн (Зураг 4D). TGF-β1-ээр эмчилсэн бүлэгтэй харьцуулахад хавсарсан эмчилгээний бүлэгт мтДНХ-ийн агууламж буурсан (Зураг 4D) нь IPA нь мтДНХ-ийн агууламжийг болон митохондрийн тоог, мөн митохондрийн амьсгалыг бууруулж болзошгүйг харуулж байна (Зураг 3C). Түүнээс гадна, IPA нь хавсарсан эмчилгээний үед мтДНХ-ийн агууламжийг бууруулсан боловч MTR-зуучлалтай митохондрийн идэвхжилд нөлөөлөөгүй (Зураг 4A–C).
Бид LX-2 эсүүдэд фиброз, апоптоз, амьд үлдэх, митохондрийн динамиктай холбоотой генийн мРНХ-ийн түвшинтэй IPA-ийн холбоог судалсан (Зураг 5A–D). Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад TGF-β1-ээр эмчилсэн бүлэгт I хэлбэрийн коллаген α2 гинж (COL1A2), α-гөлгөр булчингийн актин (αSMA), матриц металлопротеиназа 2 (MMP2), металлопротеиназа 1-ийн эдийн дарангуйлагч (TIMP1), динамин 1-тэй төстэй ген (DRP1) зэрэг генийн экспресс нэмэгдсэн нь фиброз болон идэвхжил нэмэгдэж байгааг харуулж байна. Цаашилбал, хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад TGF-β1 эмчилгээ нь цөмийн жирэмсний X рецептор (PXR), каспаза 8 (CASP8), MAPKAPK3, В эсийн α дарангуйлагч, цөмийн хүчин зүйл κ генийн гэрлийн пептидийг сайжруулагч (NFκB1A), цөмийн хүчин зүйл κB киназын дэд нэгж β дарангуйлагч (IKBKB)-ийн мРНХ-ийн түвшинг бууруулсан (Зураг 5A–D). TGF-β1 эмчилгээтэй харьцуулахад TGF-β1 болон IPA-тай хавсарсан эмчилгээ нь COL1A2 болон MMP2-ийн экспрессийг бууруулсан боловч PXR, TIMP1, B-эсийн лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, болон IKBKB-ийн mRNA түвшинг нэмэгдүүлсэн. IPA эмчилгээ нь MMP2, Bcl-2-тэй холбоотой уураг X (BAX), AKT1, харааны хатингаршлын уураг 1 (OPA1), болон митохондрийн нэгдлийн уураг 2 (MFN2)-ийн экспрессийг мэдэгдэхүйц бууруулсан бол CASP8, NFκB1A, NFκB1B, болон IKBKB-ийн экспресс нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад нэмэгдсэн. Гэсэн хэдий ч каспаза-3 (CASP3), апоптозын пептидазын идэвхжүүлэгч хүчин зүйл 1 (APAF1), митохондрийн нэгдлийн уураг 1 (MFN1), болон хуваагдлын уураг 1 (FIS1)-ийн экспрессэд ялгаа ажиглагдаагүй. Эдгээр үр дүнгүүд нь IPA эмчилгээ нь фиброз, апоптоз, амьд үлдэх, митохондрийн динамиктай холбоотой генийн экспрессийг зохицуулдаг болохыг харуулж байна. Бидний өгөгдөл нь IPA эмчилгээ нь LX-2 эсийн фиброзыг бууруулдаг болохыг харуулж байна; үүний зэрэгцээ фенотипийг идэвхгүйжүүлэх чиглэлд шилжүүлснээр амьд үлдэхийг идэвхжүүлдэг.
IPA нь LX-2 эсүүдэд фибробласт, апоптоз, амьдрах чадвар болон митохондрийн динамик генийн экспрессийг зохицуулдаг. Гистограмм нь LX-2 эсийг ийлдэсгүй орчинд TGF-β1 болон IPA-аар 24 цагийн турш өдөөсний дараа эндоген хяналт (RPLP0 эсвэл PPIA)-тай харьцуулахад mRNA экспрессийг харуулдаг. А нь фибробластуудыг, B нь апоптозтой эсүүдийг, C нь амьд үлдсэн эсүүдийг, D нь митохондрийн динамик генийн экспрессийг илэрхийлдэг. Өгөгдлийг дундаж ± стандарт хазайлт (SD), n = 3 бие даасан туршилтаар үзүүлэв. Статистик харьцуулалтыг нэг талын ANOVA болон Bonferroni post hoc тест ашиглан хийсэн. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Дараа нь эсийн хэмжээний өөрчлөлт (FSC-H) болон цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдал (SSC-H)-ийг урсгалын цитометрээр үнэлсэн (Зураг 6A, B), IPA эмчилгээний дараах эсийн морфологийн өөрчлөлтийг дамжуулалтын электрон микроскоп (TEM) болон фазын контраст микроскопоор үнэлсэн (Нэмэлт Зураг 6A-B). Хүлээгдэж байсанчлан TGF-β1-ээр эмчилсэн бүлгийн эсүүд хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хэмжээ нь нэмэгдсэн (Зураг 6A, B), энэ нь барзгар эндоплазмын торлог бүрхэвч (ER*) болон фаголизосомын (P) сонгодог тэлэлтийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь гематопоэтик үүдэл эс (HSC) идэвхжиж байгааг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 6A). Гэсэн хэдий ч TGF-β1-ээр эмчилсэн бүлэгтэй харьцуулахад TGF-β1 болон IPA хосолсон эмчилгээний бүлэгт эсийн хэмжээ, цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдал (Зураг 6A, B) болон ER*-ийн агууламж буурсан байна (Нэмэлт Зураг 6A). Цаашилбал, IPA эмчилгээ нь хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад эсийн хэмжээ, цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдал (Зураг 6A, B), P болон ER*-ийн агууламжийг бууруулсан (Нэмэлт Зураг 6A). Үүнээс гадна, хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад IPA эмчилгээ хийснээс хойш 24 цагийн дараа апоптозтой эсийн агууламж нэмэгдсэн (цагаан сум, Нэмэлт Зураг 6B). Эдгээр үр дүнгүүд нь нийтдээ 1 мМ IPA нь HSC апоптозыг өдөөж, TGF-β1-ээр өдөөгдсөн эсийн морфологийн параметрүүдийн өөрчлөлтийг буцаан, улмаар эсийн хэмжээ, нарийн төвөгтэй байдлыг зохицуулж чаддаг бөгөөд энэ нь HSC-ийн идэвхгүйжилттэй холбоотой байж болохыг харуулж байна.
IPA нь LX-2 эсүүдэд эсийн хэмжээ болон цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдлыг өөрчилдөг. Урсгалын цитометрийн шинжилгээний төлөөллийн зургууд. Шинжилгээнд LX-2 эсүүдэд зориулсан өвөрмөц хаалганы стратегийг ашигласан: эсийн популяцийг тодорхойлохын тулд SSC-A/FSC-A, давхар эсийг тодорхойлохын тулд FSC-H/FSC-A, эсийн хэмжээ болон нарийн төвөгтэй байдлын шинжилгээнд SSC-H/FSC-H. Эсүүдийг TGF-β1 (5 нг/мл) болон 1 мМ IPA-аар ийлдэсгүй орчинд 24 цагийн турш инкубацлав. LX-2 эсүүдийг эсийн хэмжээ болон цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдлын шинжилгээнд зориулж зүүн доод квадрант (SSC-H-/FSC-H-), зүүн дээд квадрант (SSC-H+/FSC-H-), баруун доод квадрант (SSC-H-/FSC-H+), баруун дээд квадрант (SSC-H+/FSC-H+) болгон хуваасан. B. Эсийн морфологийг FSC-H (урагш тархалт, эсийн хэмжээ) болон SSC-H (хажуугийн тархалт, цитоплазмын нарийн төвөгтэй байдал) (30,000 үйл явдал) ашиглан урсгалын цитометрийн аргаар шинжилсэн. Өгөгдлийг дундаж ± SD, n = 3 бие даасан туршилтаар үзүүлэв. Статистикийн харьцуулалтыг нэг талын ANOVA болон Bonferroni post hoc тест ашиглан хийсэн. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 ба ****p < 0.0001
IPA зэрэг гэдэсний метаболитууд нь судалгааны халуун сэдэв болж, гэдэсний микробиотод шинэ байг илрүүлж болохыг харуулж байна. Тиймээс бидний хүний ​​элэгний фиброзтой холбосон метаболит болох IPA нь амьтны загварт фиброзын эсрэг нэгдэл болох нь батлагдсан нь сонирхолтой юм [15]. Энд бид 2-р хэлбэрийн чихрийн шижин (T2D)-гүй таргалалттай хүмүүст сийвэнгийн IPA болон дэлхийн элэгний транскриптомик ба ДНХ-ийн метилжилтийн хоорондын холбоог анх удаа харуулж, апоптоз, митофаги ба урт наслалт, мөн элэгний гомеостазыг зохицуулдаг AKT1 генийн боломжит нэр дэвшигчийг онцолж байна. Бидний судалгааны бас нэгэн шинэлэг зүйл бол бид IPA эмчилгээний апоптоз, эсийн морфологи, митохондрийн биоэнергетик ба LX-2 эсийн динамиктай харилцан үйлчлэлийг харуулсан бөгөөд энэ нь HSC фенотипийг идэвхгүйжүүлэх чиглэлд шилжүүлдэг бага энергийн спектрийг харуулж, IPA-г элэгний фиброзыг сайжруулах боломжит нэр дэвшигч болгож байна.
Бид апоптоз, митофаги ба урт наслалт нь цусны эргэлтийн сийвэн дэх IPA-тай холбоотой элэгний генүүдээр баяжуулсан хамгийн чухал каноник замууд болохыг тогтоосон. Митохондрийн чанарын хяналтын (MQC) системийн тасалдал нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал, митофаги ба апоптозод хүргэж, улмаар MASLD үүсэхийг дэмждэг [33, 34]. Тиймээс IPA нь элгэнд апоптоз, митофаги ба урт наслалтын замаар эсийн динамик болон митохондрийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахад оролцдог гэж таамаглаж болно. Бидний өгөгдөл нь гурван шинжилгээнд хоёр ген нийтлэг байгааг харуулсан: YKT6 ба AKT1. YKT6 нь эсийн мембраны нэгдэх үйл явцад оролцдог SNARE уураг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Энэ нь аутофагосом дээр STX17 ба SNAP29-тэй эхлүүлэлтийн цогцолбор үүсгэж, улмаар аутофагосом ба лизосомын нэгдлийг дэмждэг [35]. Цаашилбал, YKT6-ийн үйл ажиллагаа алдагдах нь митофагийн үйл ажиллагааг бууруулдаг [36] бол YKT6-ийн зохицуулалт нэмэгдэх нь элэгний эсийн хавдрын (HCC) явцтай холбоотой бөгөөд эсийн амьдрах чадвар нэмэгддэг [37]. Нөгөөтэйгүүр, AKT1 нь хамгийн чухал харилцан үйлчлэлцдэг ген бөгөөд PI3K/AKT дохиоллын зам, эсийн мөчлөг, эсийн шилжилт хөдөлгөөн, тархалт, фокусын наалдац, митохондрийн үйл ажиллагаа, коллагены шүүрэл зэрэг элэгний өвчинд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг [38-40]. Идэвхжүүлсэн PI3K/AKT дохиоллын зам нь эсийн гаднах матриц (ECM) үйлдвэрлэх үүрэгтэй эсүүд болох гематопоэтик үүдэл эсийг (HSCs) идэвхжүүлж, түүний зохицуулалтын алдагдал нь элэгний фиброзын үүсэл, явцад нөлөөлж болзошгүй [40]. Үүнээс гадна, AKT нь p53-аас хамааралтай эсийн апоптозыг дарангуйлдаг эсийн амьдрах чадварын гол хүчин зүйлсийн нэг бөгөөд AKT идэвхжил нь элэгний эсийн апоптозыг дарангуйлахтай холбоотой байж болно [41, 42]. Олж авсан үр дүнгээс харахад IPA нь элэгний митохондритай холбоотой апоптозд оролцож болох бөгөөд апоптоз руу орох эсвэл амьд үлдэх хоёрын хоорондох гепатоцитын шийдвэрт нөлөөлж болно. Эдгээр нөлөөг элэгний гомеостазын хувьд чухал ач холбогдолтой AKT болон/эсвэл YKT6 нэр дэвшигч генүүд зохицуулж болно.
Бидний үр дүнгээс харахад 1 мМ IPA нь TGF-β1 эмчилгээнээс хамааралгүйгээр LX-2 эсүүдэд апоптозыг өдөөж, митохондрийн амьсгалыг бууруулдаг болохыг харуулсан. Апоптоз нь фиброзын эмчилгээ болон гематопоэтик үүдэл эс (HSC)-ийн идэвхжлийн гол зам бөгөөд элэгний фиброзын эргэлт буцалтгүй физиологийн хариу урвалын гол үйл явдал гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй [4, 43]. Түүнчлэн, хавсарсан эмчилгээний дараа LX-2 эсүүдэд BHI-ийн сэргэлт нь митохондрийн биоэнергетикийг зохицуулахад IPA-ийн боломжит үүргийн талаар шинэ ойлголт өгсөн. Амрах болон идэвхгүй нөхцөлд гематопоэтик эсүүд нь митохондрийн исэлдэлтийн фосфоржуулалтыг ашиглан ATP үүсгэдэг бөгөөд бодисын солилцооны идэвхжил багатай байдаг. Нөгөөтэйгүүр, HSC-ийн идэвхжил нь гликолитик төлөвт орох энергийн хэрэгцээг нөхөхийн тулд митохондрийн амьсгал ба биосинтезийг сайжруулдаг [44]. IPA нь бодисын солилцооны чадавхи болон ECAR-д нөлөөлөөгүй нь гликолитик зам нь бага ач холбогдолтой болохыг харуулж байна. Үүнтэй адилаар өөр нэг судалгаагаар 1 мМ IPA нь кардиомиоцит, хүний ​​гепатоцитын эсийн шугам (Huh7) болон хүний ​​хүйн ​​венийн эндотел эсүүд (HUVEC)-д митохондрийн амьсгалын гинжин хэлхээний идэвхжилийг зохицуулж чаддаг болохыг харуулсан; Гэсэн хэдий ч IPA нь кардиомиоцит дахь гликолизд ямар ч нөлөө үзүүлээгүй бөгөөд энэ нь IPA нь бусад эсийн төрлүүдийн биоэнергетикт нөлөөлж болзошгүйг харуулж байна [45]. Тиймээс бид 1 мМ IPA нь mtDNA-ийн хэмжээг өөрчлөхгүйгээр фиброгенийн генийн экспресс, эсийн морфологи, митохондрийн биоэнергетикийг мэдэгдэхүйц бууруулж чаддаг тул зөөлөн химийн салгагч болж чадна гэж таамаглаж байна [46]. Митохондрийн салгагч нь өсгөврөөр өдөөгдсөн фиброз болон HSC идэвхжлийг дарангуйлж [47], салгах уургууд (UCP) эсвэл аденин нуклеотидын транслоказа (ANT) зэрэг тодорхой уургуудаар зохицуулагддаг эсвэл өдөөгддөг митохондрийн ATP үйлдвэрлэлийг бууруулж чаддаг. Эсийн төрлөөс хамааран энэ үзэгдэл нь эсийг апоптозоос хамгаалж,/эсвэл апоптозыг дэмждэг [46]. Гэсэн хэдий ч IPA нь гематопоэтик үүдэл эсийг идэвхгүйжүүлэхэд митохондрийн салгагч болох үүргийг тодруулахын тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна.
Дараа нь бид митохондрийн амьсгалын өөрчлөлт нь амьд LX-2 эсүүдийн митохондрийн морфологид тусгалаа олсон эсэхийг судалсан. Сонирхолтой нь, TGF-β1 эмчилгээ нь митохондрийн харьцааг бөмбөрцөг хэлбэрээс завсрын хэлбэрт шилжүүлж, митохондрийн салаалалтыг бууруулж, митохондрийн хуваагдлын гол хүчин зүйл болох DRP1-ийн экспрессийг нэмэгдүүлдэг [48]. Цаашилбал, митохондрийн хуваагдал нь сүлжээний ерөнхий нарийн төвөгтэй байдалтай холбоотой бөгөөд нэгдлээс хуваагдал руу шилжих нь гематопоэтик үүдэл эс (HSC)-ийн идэвхжилд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг бол митохондрийн хуваагдлыг дарангуйлах нь HSC-ийн апоптозод хүргэдэг [49]. Тиймээс бидний үр дүнгээс харахад TGF-β1 эмчилгээ нь салбарлалт буурснаар митохондрийн сүлжээний нарийн төвөгтэй байдлыг бууруулж болзошгүй бөгөөд энэ нь идэвхжүүлсэн гематопоэтик үүдэл эс (HSC)-тэй холбоотой митохондрийн хуваагдалд илүү түгээмэл тохиолддог. Цаашилбал, бидний өгөгдөл нь IPA нь митохондрийн харьцааг бөмбөрцөг хэлбэрээс завсрын хэлбэрт өөрчилж, улмаар OPA1 болон MFN2-ийн экспрессийг бууруулж болохыг харуулсан. Судалгаагаар OPA1-ийн бууралт нь митохондрийн мембраны потенциалыг бууруулж, эсийн апоптозыг өдөөж болохыг харуулсан [50]. MFN2 нь митохондрийн нэгдэл болон апоптозыг зохицуулдаг гэдгээрээ алдартай [51]. Олж авсан үр дүнгээс харахад TGF-β1 болон/эсвэл IPA-аар LX-2 эсийг өдөөх нь митохондрийн хэлбэр, хэмжээг, мөн идэвхжүүлэлтийн төлөв байдал болон сүлжээний нарийн төвөгтэй байдлыг өөрчилдөг бололтой.
Бидний үр дүнгээс харахад TGFβ-1 болон IPA-ийн хавсарсан эмчилгээ нь апоптозоос зайлсхийдэг эсүүдэд фиброз, апоптоз болон амьд үлдэхтэй холбоотой генүүдийн mRNA экспрессийг зохицуулснаар mtDNA болон эсийн морфологийн параметрүүдийг бууруулж чадна. Үнэндээ IPA нь AKT1 болон COL1A2 болон MMP2 зэрэг чухал фиброзын генүүдийн mRNA экспрессийн түвшинг бууруулсан боловч апоптозтой холбоотой CASP8-ийн экспрессийн түвшинг нэмэгдүүлсэн. Бидний үр дүнгээс харахад IPA эмчилгээний дараа BAX экспресс буурч, TIMP1 гэр бүлийн дэд нэгж болох BCL-2 болон NF-κB-ийн mRNA экспресс нэмэгдсэн нь IPA нь апоптозоос зайлсхийдэг гематопоэтик үүдэл эсүүд (HSCs)-д амьд үлдэх дохиог өдөөж болохыг харуулж байна. Эдгээр молекулууд нь идэвхжүүлсэн гематопоэтик үүдэл эсүүдэд амьд үлдэх дохио болж үйлчилдэг бөгөөд энэ нь апоптозын эсрэг уургуудын (жишээлбэл, Bcl-2) экспрессийг нэмэгдүүлэх, апоптозын эсрэг BAX-ийн экспрессийг бууруулах, TIMP болон NF-κB-ийн хоорондын нарийн төвөгтэй харилцан үйлчлэлтэй холбоотой байж болно [5, 7]. IPA нь PXR-ээр дамжуулан үр нөлөөгөө үзүүлдэг бөгөөд бид TGF-β1 болон IPA-тай хавсарсан эмчилгээ нь PXR mRNA экспрессийн түвшинг нэмэгдүүлж, HSC идэвхжлийг дарангуйлж байгааг харуулж байгааг тогтоосон. Идэвхжүүлсэн PXR дохиолол нь in vivo болон in vitro аль алинд нь HSC идэвхжлийг дарангуйлдаг нь мэдэгдэж байна [52, 53]. Бидний үр дүнгээс харахад IPA нь апоптозыг дэмжих, фиброз болон митохондрийн бодисын солилцоог бууруулах, амьд үлдэх дохиог сайжруулах замаар идэвхжүүлсэн HSC-ийн цэвэрлэгээнд оролцож болох бөгөөд эдгээр нь идэвхжүүлсэн HSC фенотипийг идэвхгүй болгосон болгон хувиргадаг ердийн үйл явц юм. Апоптоз дахь IPA-ийн боломжит механизм болон үүргийн өөр нэг боломжит тайлбар нь энэ нь голчлон митофаги (дотоод зам) болон гадаад TNF дохиоллын замаар (Хүснэгт 1) үйл ажиллагааны алдагдалтай митохондрийг цэвэрлэдэг бөгөөд энэ нь NF-κB амьд үлдэх дохиоллын замтай шууд холбоотой (Нэмэлт Зураг 7). Сонирхолтой нь, IPA-тай холбоотой баяжуулсан генүүд нь апоптозын замд апоптозыг дэмжих болон амьд үлдэхийг дэмжих дохиог өдөөх чадвартай [54] бөгөөд энэ нь IPA нь эдгээр генүүдтэй харилцан үйлчлэлцэх замаар апоптоз буюу амьд үлдэхийг өдөөж болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч IPA нь HSC идэвхжлийн үед апоптоз буюу амьд үлдэхийг хэрхэн өдөөдөг болон түүний механизмын замууд нь тодорхойгүй хэвээр байна.
IPA нь гэдэсний микробиотоор дамжин хоол хүнсээр триптофанаас үүссэн бичил биетний метаболит юм. Судалгаагаар энэ нь гэдэсний орчинд үрэвслийн эсрэг, антиоксидант, эпигенетикийн зохицуулалтын шинж чанартай болохыг харуулсан. [55] Судалгаагаар IPA нь гэдэсний саад тотгорын үйл ажиллагааг зохицуулж, исэлдэлтийн стрессийг бууруулж чаддаг бөгөөд энэ нь түүний орон нутгийн физиологийн нөлөөнд хувь нэмэр оруулж болзошгүйг харуулсан. [56] Үнэндээ IPA нь цусны эргэлтээр дамжуулан зорилтот эрхтэнд дамждаг бөгөөд IPA нь триптофан, серотонин, индолын деривативуудтай ижил төстэй үндсэн метаболитын бүтэцтэй тул IPA нь бодисын солилцооны үйл ажиллагааг явуулдаг бөгөөд үүний үр дүнд бодисын солилцооны хувь тавилан өрсөлдөх чадвартай болдог. [52] IPA нь фермент эсвэл рецептор дээр холбогдох газруудын төлөө триптофанаас гаралтай метаболитуудтай өрсөлдөж, хэвийн бодисын солилцооны замыг алдагдуулж болзошгүй юм. Энэ нь түүний эмчилгээний цонхыг илүү сайн ойлгохын тулд түүний фармакокинетик ба фармакодинамикийн талаар цаашид судлах шаардлагатай байгааг харуулж байна. [57] Энэ нь гематопоэтик үүдэл эсүүдэд (HSCs) тохиолдож болох эсэхийг харах л үлдлээ.
Бидний судалгаа зарим хязгаарлалттай гэдгийг бид хүлээн зөвшөөрч байна. IPA-тай холбоотой холбоог тусгайлан судлахын тулд бид 2-р хэлбэрийн чихрийн шижин (T2DM)-тэй өвчтөнүүдийг хассан. Энэ нь бидний олдворын өргөн хэрэглээг 2-р хэлбэрийн чихрийн шижин болон элэгний хүнд өвчтэй өвчтөнүүдэд хязгаарлаж байгааг бид хүлээн зөвшөөрч байна. Хүний сийвэн дэх IPA-ийн физиологийн концентраци нь 1-10 μM [11, 20] боловч 1 мМ IPA-ийн концентрацийг хамгийн өндөр хоргүй концентраци [15] болон хамгийн өндөр апоптозын түвшинд үндэслэн сонгосон бөгөөд үхжилтэй эсийн популяцийн хувьд ялгаагүй. Энэхүү судалгаанд IPA-ийн физиологийн түвшинг ашигласан боловч IPA-ийн үр дүнтэй тунгийн талаар одоогоор нэгдсэн ойлголт байхгүй байна [52]. Бидний үр дүн ач холбогдолтой боловч IPA-ийн өргөн хүрээтэй бодисын солилцооны хувь тавилан нь судалгааны идэвхтэй чиглэл хэвээр байна. Түүнчлэн, сийвэн дэх IPA-ийн түвшин болон элэгний транскрипцийн ДНХ-ийн метилжилтийн хоорондын хамаарлын талаарх бидний олдворуудыг зөвхөн гематопоэтик үүдэл эсүүдээс (HSCs) гадна элэгний эдээс авсан болно. Бид IPA нь гематопоэтик үүдэл эс (HSC)-ийн идэвхжилтэй холбоотой гэсэн өмнөх транскриптомын шинжилгээний үр дүнд хүний ​​LX-2 эсийг ашиглахаар сонгосон [15] бөгөөд HSC нь элэгний фиброзын хөгжилд оролцдог гол эсүүд юм. Элэг нь олон төрлийн эсээс бүрддэг тул IPA-ийн үүрэг болон түүний бусад элэгний эсийн төрлүүдтэй харилцан үйлчлэлийг судлахын тулд гепатоцит-HSC-дархлааны эсийн хам өсгөврийн систем, каспазын идэвхжил болон ДНХ-ийн хуваагдал, түүнчлэн уургийн түвшин зэрэг үйлчлэх механизмыг хослуулан бусад эсийн загваруудыг авч үзэх хэрэгтэй.