Энэ өгүүлэл нь "Буурцагт ургамлын эмгэг төрүүлэгч болон хортон шавьжид тэсвэртэй байдлыг сайжруулах нь" судалгааны сэдвийн нэг хэсэг бөгөөд бүх 5 өгүүллийг үзнэ үү.
Мөөгөнцрийн ургамлын үхжилийн өвчний үүсгэгч бодис болох Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary нь янз бүрийн эзэн ургамлыг халдварлуулахын тулд олон шатлалт стратеги ашигладаг. Энэхүү судалгаагаар Pseudomonas sclerotiorum-ийн улмаас үүссэн цагаан хөгцний эсрэг Phaseolus vulgaris L.-ийн молекул, физиологийн болон биохимийн хариу урвалыг сайжруулахын тулд бусад чухал амин хүчлүүдийн нийлэгжилтийг өдөөдөг уураггүй амин хүчил болох диамин L-орнитиныг өөр менежментийн стратеги болгон ашиглахыг санал болгож байна. In vitro туршилтаар L-орнитин нь тунгаас хамааралтай байдлаар S. pyrenoidosa-ийн мицелийн өсөлтийг мэдэгдэхүйц дарангуйлдаг болохыг харуулсан. Түүнээс гадна, энэ нь хүлэмжийн нөхцөлд цагаан хөгцний ноцтой байдлыг мэдэгдэхүйц бууруулж чадна. Цаашилбал, L-орнитин нь боловсруулсан ургамлын өсөлтийг өдөөсөн бөгөөд энэ нь L-орнитины туршсан концентраци нь боловсруулсан ургамалд фитотоксик биш болохыг харуулж байна. Үүнээс гадна, L-орнитин нь ферментийн бус антиоксидантууд (нийт уусдаг фенолик ба флавоноид) болон ферментийн антиоксидантууд (каталаза (CAT), пероксидаза (POX), полифенол оксидаза (PPO))-ийн экспрессийг сайжруулж, антиоксиданттай холбоотой гурван генийн (PvCAT1, PvSOD, PvGR) экспрессийг нэмэгдүүлсэн. Цаашилбал, цахиурын шинжилгээгээр S. sclerotiorum геномд оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) уураг байгааг тогтоосон бөгөөд энэ нь функциональ шинжилгээ, хадгалагдсан домэйн, топологийн хувьд Aspergillus fijiensis (AfOAH) болон Penicillium sp. (PlOAH)-ийн оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) уургуудтай маш төстэй байв. Сонирхолтой нь, төмсний декстрозын шөл (PDB) орчинд L-орнитин нэмэх нь S. sclerotiorum mycelia дахь SsOAH генийн экспрессийг мэдэгдэхүйц бууруулсан. Үүнтэй адилаар, L-орнитиныг гадны хэрэглээ нь боловсруулсан ургамлаас цуглуулсан мөөгөнцрийн мицелид SsOAH генийн экспрессийг мэдэгдэхүйц бууруулсан. Эцэст нь, L-орнитиныг хэрэглэх нь PDB орчин болон халдвар авсан навчнуудад оксалийн хүчлийн шүүрлийг мэдэгдэхүйц бууруулсан. Дүгнэж хэлэхэд, L-орнитин нь исэлдэн ангижрах төлөвийг хадгалахаас гадна халдвар авсан ургамлын хамгаалалтын хариу урвалыг сайжруулахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг. Энэхүү судалгааны үр дүн нь цагаан хөгцийг хянах, шошны үйлдвэрлэл болон бусад ургацад үзүүлэх нөлөөллийг бууруулах шинэлэг, байгаль орчинд ээлтэй аргуудыг боловсруулахад тусалж магадгүй юм.
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary үхжил үүсгэдэг мөөгөнцөрөөс үүдэлтэй цагаан хөгц нь дэлхий даяарх шош (Phaseolus vulgaris L.)-ийн үйлдвэрлэлд ноцтой аюул учруулдаг сүйрлийн, ургац бууруулдаг өвчин юм (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum нь хөрсөнд тархдаг мөөгөнцрийн ургамлын эмгэг төрүүлэгчдийн нэг бөгөөд 600 гаруй ургамлын төрөл зүйлийн өргөн хүрээтэй, өвөрмөц бус аргаар эзэн эдийг хурдан устгах чадвартай (Liang and Rollins, 2018). Тааламжгүй нөхцөлд энэ нь амьдралын мөчлөгийнхөө чухал үе шатанд орж, хөрсөнд "sclerotia" гэж нэрлэгддэг хар, хатуу, үр шиг бүтэц хэлбэрээр эсвэл халдвар авсан ургамлын мицели буюу ишний голд цагаан, сэвсгэр өсөлт хэлбэрээр удаан хугацаанд унтаа байдалд ордог (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum нь склеротиа үүсгэх чадвартай бөгөөд энэ нь халдвар авсан талбайд удаан хугацаанд амьдрах, өвчний үед үлдэх боломжийг олгодог (Schwartz et al., 2005). Склеротиа нь шим тэжээлээр баялаг, хөрсөнд удаан хугацаанд оршин тогтнож, дараагийн халдварын анхдагч тарилга болж чаддаг (Schwartz et al., 2005). Тааламжтай нөхцөлд склеротиа нь соёолж, агаараар дамжин тархдаг спор үүсгэдэг бөгөөд энэ нь ургамлын бүх газрын дээрх хэсэгт, түүний дотор цэцэг, иш, хонхорцог зэрэг халдварлах чадвартай (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum нь эзэн ургамлаа халдварлуулахын тулд олон шатлалт стратеги ашигладаг бөгөөд склеротиал соёололтоос эхлээд шинж тэмдгийн хөгжил хүртэл хэд хэдэн зохицуулалттай үйл явдлыг хамардаг. Эхэндээ S. sclerotiorum нь апотекиа гэж нэрлэгддэг мөөг төст бүтцээс түдгэлзсэн спор (аскоспор гэж нэрлэгддэг) үүсгэдэг бөгөөд энэ нь агаарт тархаж, халдвар авсан ургамлын үлдэгдэл дээр хөдөлгөөнгүй склероти болж хөгждөг (Bolton et al., 2006). Дараа нь мөөгөнцөр нь ургамлын эсийн ханын рН-ийг хянах, ферментийн задрал, эд эсийн нэвчилтийг дэмжих (Hegedus and Rimmer, 2005), эзэн ургамлын исэлдэлтийн тэсрэлтийг дарангуйлахын тулд хоруу чанарын хүчин зүйл болох оксалийн хүчил ялгаруулдаг. Энэхүү хүчиллэгжүүлэх үйл явц нь ургамлын эсийн ханыг сулруулж, мөөгөнцрийн эсийн ханыг задалдаг ферментүүд (CWDEs)-ийн хэвийн, үр дүнтэй ажиллах таатай орчныг бүрдүүлж, эмгэг төрүүлэгч нь физик саадыг даван туулж, эзэн эд эсэд нэвтрэх боломжийг олгодог (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum нь нэвтэрсний дараа полигалактуроназа ба целлюлаза зэрэг хэд хэдэн CWDE-г ялгаруулдаг бөгөөд энэ нь халдвар авсан эдэд тархалтыг хөнгөвчилж, эдийн үхжил үүсгэдэг. Гэмтэл ба гифал дэвсгэрийн явц нь цагаан хөгцний шинж тэмдгүүдэд хүргэдэг (Hegedus and Rimmer, 2005). Үүний зэрэгцээ, эзэн ургамал нь хэв маягийг таних рецепторууд (PRRs)-аар дамжуулан эмгэг төрүүлэгчтэй холбоотой молекулын хэв маягийг (PAMPs) таньж, эцэст нь хамгаалалтын хариу урвалыг идэвхжүүлдэг цуврал дохиоллын үйл явдлыг өдөөдөг.
Өвчний хяналтын олон арван жилийн хүчин чармайлтаас үл хамааран бусад арилжааны ургацын нэгэн адил шошонд хангалттай тэсвэртэй үр хөврөлийн дутагдал байсаар байгаа нь эмгэг төрүүлэгчийн эсэргүүцэл, амьдрах чадвар, дасан зохицох чадвараас шалтгаалан байна. Тиймээс өвчний менежмент нь маш хэцүү бөгөөд соёлын дадал зуршил, биологийн хяналт, химийн фунгицидын хослолыг багтаасан нэгдсэн, олон талт стратеги шаарддаг (O'Sullivan et al., 2021). Цагаан хөгцний химийн хяналт нь хамгийн үр дүнтэй байдаг, учир нь фунгицидыг зөв, зөв ​​цагт нь хэрэглэвэл өвчний тархалтыг үр дүнтэй хянаж, халдварын хүндрэлийг бууруулж, ургацын алдагдлыг багасгаж чадна. Гэсэн хэдий ч фунгицидыг хэт их хэрэглэх, хэт их хэрэглэх нь S. sclerotiorum-ийн тэсвэртэй омгууд үүсэхэд хүргэж, зорилтот бус организмууд, хөрсний эрүүл мэнд, усны чанарт сөргөөр нөлөөлдөг (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Тиймээс байгаль орчинд ээлтэй хувилбаруудыг олох нь нэн тэргүүний зорилт болсон.
Путресцин, спермидин, спермин, кадаврин зэрэг полиаминууд (PA) нь хөрсөнд тархдаг ургамлын эмгэг төрүүлэгчдийн эсрэг ирээдүйтэй хувилбар болж, улмаар аюултай химийн фунгицидын хэрэглээг бүрэн эсвэл хэсэгчлэн бууруулдаг (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Дээд ургамлын хувьд PA нь эсийн хуваагдал, ялгарал, абиотик ба биотик стрессд үзүүлэх хариу урвал зэрэг олон физиологийн процесст оролцдог (Killiny and Nehela, 2020). Тэдгээр нь антиоксидант болж, реактив хүчилтөрөгчийн төрөл зүйлийг (ROS) цэвэрлэхэд тусалдаг, исэлдэн ангижрах гомеостазыг хадгалдаг (Nehela болон Killiny, 2023), хамгаалалттай холбоотой генийг өдөөдөг (Romero et al., 2018), янз бүрийн бодисын солилцооны замыг зохицуулдаг (Nehela болон Killiny, 2023), эндоген фитохормонуудыг зохицуулдаг (Nehela болон Killiny, 2019), системийн олдмол эсэргүүцлийг (SAR) бий болгодог, ургамал-эмгэг төрүүлэгчийн харилцан үйлчлэлийг зохицуулдаг (Nehela болон Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ургамлын хамгаалалтад PA-ийн тодорхой механизм, үүрэг нь ургамлын төрөл зүйл, эмгэг төрүүлэгчид, хүрээлэн буй орчны нөхцөл байдлаас хамааран өөр өөр байдаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Ургамалд хамгийн их агуулагддаг PA нь зайлшгүй шаардлагатай полиамин L-орнитинээс биосинтезлэгддэг (Killiny болон Nehela, 2020).
L-орнитин нь ургамлын өсөлт хөгжилтөд олон үүрэг гүйцэтгэдэг. Жишээлбэл, өмнөх судалгаагаар будаа (Oryza sativa)-д орнитин нь азотын дахин боловсруулалттай (Liu et al., 2018), будааны ургац, чанар, үнэр (Lu et al., 2020), усны стрессийн хариу урвалтай (Yang et al., 2000) холбоотой байж болохыг харуулсан. Цаашилбал, L-орнитиныг гадны хэрэглээ нь чихрийн манжин (Beta vulgaris)-д ган гачигт тэсвэртэй байдлыг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлж (Hussein et al., 2019), сонгино (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu болон Çavuşoǧlu, 2021) болон кешью (Anacardium occidentale)-д давсны стрессийг бууруулсан (da Rocha et al., 2012). Абиотик стрессээс хамгаалахад L-орнитины боломжит үүрэг нь боловсруулсан ургамалд пролин хуримтлагдахад оролцдогтой холбоотой байж болох юм. Жишээлбэл, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-OAT) болон пролин дегидрогеназа (ProDH1 ба ProDH2) генүүд зэрэг пролины солилцоотой холбоотой генүүд нь Nicotiana benthamiana болон Arabidopsis thaliana-г эзэн бус Pseudomonas syringae омгуудаас хамгаалахад оролцдог гэж өмнө нь мэдээлсэн байсан (Senthil-Kumar ба Mysore, 2012). Нөгөөтэйгүүр, мөөгөнцрийн орнитин декарбоксилаза (ODC) нь эмгэг төрүүлэгчийн өсөлтөд шаардлагатай байдаг (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-ийн ODC-г эзэн өдөөгдсөн генийн чимээгүйжүүлэлт (HIGS)-ээр дамжуулан чиглүүлэх нь улаан лоолийн ургамлын Fusarium гандах эсэргүүцлийг мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлсэн (Singh et al., 2020). Гэсэн хэдий ч фитопатоген зэрэг биотик стрессийн эсрэг экзоген орнитин хэрэглэх боломжит үүргийг сайн судлаагүй байна. Хамгийн чухал нь орнитины өвчинд тэсвэртэй байдал болон түүнтэй холбоотой биохимийн болон физиологийн үзэгдлүүдэд үзүүлэх нөлөө нь бараг судлагдаагүй хэвээр байна.
Буурцагт ургамлын S. sclerotiorum халдварын нарийн төвөгтэй байдлыг ойлгох нь үр дүнтэй хяналтын стратеги боловсруулахад чухал ач холбогдолтой. Энэхүү судалгаанд бид буурцагт ургамлын хамгаалалтын механизм болон Sclerotinia sclerotiorum халдварт тэсвэртэй байдлыг сайжруулах гол хүчин зүйл болох диамин L-орнитиныг тодорхойлохыг зорьсон. Халдвар авсан ургамлын хамгаалалтын хариу урвалыг сайжруулахаас гадна L-орнитин нь исэлдэн ангижрах төлөв байдлыг хадгалахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг гэж бид таамаглаж байна. L-орнитины болзошгүй нөлөө нь ферментийн болон ферментийн бус антиоксидант хамгаалалтын механизмыг зохицуулах, мөөгөнцрийн эмгэг төрүүлэгч чанар/хор хөнөөлийн хүчин зүйлс болон холбогдох уургуудтай холбоотой хөндлөнгийн оролцоотой холбоотой гэж бид үзэж байна. L-орнитины энэхүү хос функц нь цагаан хөгцний нөлөөллийг бууруулах, нийтлэг буурцагт ургамлын ургацын энэхүү хүчтэй мөөгөнцрийн эмгэг төрүүлэгчдэд тэсвэртэй байдлыг нэмэгдүүлэх тогтвортой стратегийн ирээдүйтэй нэр дэвшигч болгож байна. Одоогийн судалгааны үр дүн нь цагаан хөгцийг хянах, буурцагт ургамлын үйлдвэрлэлд үзүүлэх нөлөөллийг бууруулах шинэлэг, байгаль орчинд ээлтэй аргуудыг боловсруулахад тусалж магадгүй юм.
Энэхүү судалгаанд туршилтын материал болгон энгийн шошны мэдрэмтгий арилжааны төрөл болох Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3)-ийг ашигласан. Эрүүл үрийг Египетийн Хөдөө аж ахуйн судалгааны төвийн (ARC) Талбайн ургацын судалгааны хүрээлэнгийн (FCRI) буурцагт ургамлын судалгааны хэлтсээс эелдэгээр нийлүүлсэн. Таван үрийг хүлэмжийн нөхцөлд (25 ± 2 °C, харьцангуй чийгшил 75 ± 1%, 8 цаг гэрэлтэй/16 цаг харанхуй) S. sclerotiorum-оор халдварлагдсан хөрсөөр дүүргэсэн хуванцар саванд (дотоод диаметр 35 см, гүн 50 см) тарьсан. Тариалснаас хойш 7-10 хоногийн дараа (DPS) суулгацыг сийрэгжүүлж, сав бүрт зөвхөн хоёр суулгац, гурван бүрэн дэлгэрсэн навч үлдээсэн. Саванд тарьсан бүх ургамлыг хоёр долоо хоног тутамд нэг удаа усалж, тухайн сортын санал болгосон хэмжээгээр сар бүр бордуулсан.
500 мг/л концентрацитай L-орнитиндиамин ((+)-(S)-2,5-диаминопентанойн хүчил гэгддэг; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Герман) бэлтгэхийн тулд эхлээд 50 мг-ийг 100 мл ариутгасан нэрмэл усанд уусгасан. Дараа нь үндсэн уусмалыг шингэлж, дараагийн туршилтуудад ашигласан. Товчхондоо, L-орнитины зургаан цуврал концентрацийг (12.5, 25, 50, 75, 100, 125 мг/л) in vitro нөхцөлд туршсан. Үүнээс гадна, ариутгасан нэрмэл усыг сөрөг хяналт (Mock) болгон ашиглаж, арилжааны фунгицид болох "Rizolex-T" 50% норгодог нунтаг (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Египет) эерэг хяналт болгон ашигласан. Арилжааны зориулалттай “Rizolex-T” фунгицидыг таван концентрацид (2, 4, 6, 8 ба 10 мг/л) in vitro нөхцөлд туршсан.
Цагаан хөгцний ердийн шинж тэмдэг илэрсэн (халдварын түвшин: 10-30%) нийтлэг шошны иш, хонхорцогны дээжийг арилжааны фермүүдээс цуглуулсан. Халдвар авсан ургамлын ихэнхийг төрөл зүйл/төрлөөр нь тодорхойлсон боловч (мэдрэмтгий арилжааны сорт Гиза 3) бусад нь, ялангуяа орон нутгийн зах зээлээс авсан нь тодорхойгүй төрөл зүйл байв. Цуглуулсан халдвар авсан материалыг эхлээд 0.5% натрийн гипохлоритын уусмалаар 3 минутын турш гадаргууг ариутгаж, дараа нь ариутгасан нэрмэл усаар хэд хэдэн удаа зайлж, илүүдэл усыг зайлуулахын тулд ариутгасан шүүлтүүрийн цаасаар арчиж хатаасан. Дараа нь халдвар авсан эрхтнүүдийг дунд эдээс (эрүүл болон халдвар авсан эдүүдийн хооронд) жижиг хэсгүүдэд хувааж, төмсний декстрозын агар (PDA) орчинд өсгөвөрлөж, склероти үүсэхийг өдөөхийн тулд 25 ± 2 °C температурт 12 цагийн гэрэл/12 цагийн харанхуй мөчлөгөөр 5 хоног инкубацлав. Мицелийн үзүүрийн аргыг мөн холимог эсвэл бохирдсон өсгөвөрөөс мөөгөнцрийн тусгаарлагдсан хэсгийг цэвэрлэхэд ашигласан. Цэвэршүүлсэн мөөгөнцрийн тусгаарлагчийг эхлээд түүний өсгөврийн морфологийн шинж чанарт үндэслэн тодорхойлж, дараа нь микроскопийн шинж чанарт үндэслэн S. sclerotiorum болохыг баталгаажуулсан. Эцэст нь бүх цэвэршүүлсэн тусгаарлагчийг Кохын постулатыг хангахын тулд мэдрэмтгий нийтлэг шошны сорт Giza 3 дээр эмгэг төрүүлэгч чанарыг нь туршсан.
Үүнээс гадна, хамгийн инвазив S. sclerotiorum тусгаарлагчийг (изолят #3) White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017-д тайлбарласны дагуу дотоод транскрипцийн зай хураагуур (ITS) дарааллын үндсэн дээр цаашид баталгаажуулсан. Товчхондоо, тусгаарлагчийг төмсний декстрозын шөлөнд (PDB) өсгөвөрлөж, 25 ± 2 °C-д 5-7 хоногийн турш инкубацлав. Дараа нь мөөгөнцрийн мицелийг цуглуулж, бяслагаар шүүж, ариутгасан усаар хоёр удаа угааж, ариутгасан шүүлтүүрийн цаасаар хатаав. Геномын ДНХ-г Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) ашиглан тусгаарласан. Дараа нь ITS рДНХ-ийн бүсийг тодорхой праймер хос ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; хүлээгдэж буй хэмжээ: 540 bp) ашиглан олшруулсан (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Цэвэршүүлсэн ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг дараалал тогтооход оруулсан (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS рДНХ-ийн дарааллыг Sanger дарааллын аргыг ашиглан хоёр чиглэлд дараалуулсан. Дараа нь угсарсан асуулгын дарааллыг BLASTn програм хангамжийг ашиглан GenBank болон Биотехнологийн мэдээллийн үндэсний төвийн (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) хамгийн сүүлийн үеийн өгөгдөлтэй харьцуулсан. Асуулгын дарааллыг Молекул хувьслын генетикийн шинжилгээний багц (MEGA-11; хувилбар 11) (Kumar et al., 2024) дахь ClustalW ашиглан NCBI GenBank (Нэмэлт хүснэгт S1)-ийн хамгийн сүүлийн үеийн өгөгдлөөс авсан бусад 20 S. sclerotiorum омог/изоляттай харьцуулсан. Хувьслын шинжилгээг хамгийн их магадлалын арга болон ерөнхий цаг хугацааны хувьд буцаах боломжтой нуклеотидын орлуулалтын загвар (Nei and Kumar, 2000) ашиглан хийсэн. Хамгийн өндөр логарифмын магадлалтай модыг харуулав. Эвристик хайлтын анхны модыг хөрш зэргэлдээх (NJ) мод (Kumar et al., 2024) болон хамгийн их хуваарилалттай (MP) модны хооронд өндөр логарифмын магадлалтай модыг сонгосноор сонгоно. NJ модыг ерөнхий цаг хугацааны хувьд буцаах боломжтой загвар (Nei and Kumar, 2000) ашиглан тооцоолсон хос зайн матриц ашиглан бүтээсэн.
L-орнитин болон нян устгах “Rizolex-T”-ийн бактерийн эсрэг идэвхийг агарын диффузийн аргаар in vitro тодорхойлсон. Арга: L-орнитины нөөц уусмалаас (500 мг/л) зохих хэмжээг авч, 10 мл PDA тэжээлийн орчинтой сайтар хольж, тус тус 12.5, 25, 50, 75, 100 болон 125 мг/л эцсийн концентрацитай уусмал бэлтгэнэ. Хяналтын хувьд таван концентрацитай “Rizolex-T” мөөгөнцрийн эсрэг бодис (2, 4, 6, 8 болон 10 мг/л) болон ариутгасан нэрмэл усыг ашигласан. Орчны бодис хатуурсны дараа шинээр бэлтгэсэн 4 мм диаметртэй Sclerotinia sclerotiorum өсгөврийн мицелийн бөглөөг Петрийн аяганы төв рүү шилжүүлж, мицели нь хяналтын Петрийн аяганы бүх хэсгийг бүрхэх хүртэл 25±2°C температурт өсгөвөрлөж, үүний дараа мөөгөнцрийн өсөлтийг бүртгэсэн. 1-р тэгшитгэлийг ашиглан S. sclerotiorum-ийн радиаль өсөлтийн дарангуйллын хувийг тооцоолно уу:
Туршилтыг хоёр удаа давтан хийсэн бөгөөд хяналтын/туршилтын бүлэг тус бүрт зургаан биологийн давталт, биологийн давталт тус бүрт таван сав (саванд хоёр ургамал) хийсэн. Туршилтын үр дүнгийн нарийвчлал, найдвартай байдал, давтагдах чадварыг баталгаажуулахын тулд биологийн давталт бүрийг хоёр удаа (хоёр техникийн давталт) шинжилсэн. Үүнээс гадна, хагас хамгийн их дарангуйлах концентраци (IC50) болон IC99 (Prentice, 1976)-ийг тооцоолоход пробит регрессийн шинжилгээг ашигласан.
Хүлэмжийн нөхцөлд L-орнитины чадавхийг үнэлэхийн тулд дараалсан хоёр савны туршилт хийсэн. Товчхондоо, савнуудыг ариутгасан шавар-элсний хөрсөөр (3:1) дүүргэж, шинээр бэлтгэсэн S. sclerotiorum өсгөврөөр тарьсан. Нэгдүгээрт, S. sclerotiorum-ийн хамгийн инвазив тусгаарлагч (3-р тусгаарлагч)-ийг нэг склеротиумыг хоёр хувааж, PDA дээр доош харуулан байрлуулж, мицелийн өсөлтийг идэвхжүүлэхийн тулд 25°C-д тогтмол харанхуйд (24 цаг) 4 хоног инкубаци хийж өсгөвөрлөв. Дараа нь урд ирмэгээс нь 5 мм диаметртэй дөрвөн агар залгуурыг авч, 100 г ариутгасан улаан буудай, будааны хивэгний холимогоор (1:1, v/v) тарьж, бүх колбыг 25 ± 2°C-д 12 цагийн гэрэл/12 цагийн харанхуй мөчлөгийн дор 5 хоногийн турш инкубаци хийж, склеротиа үүсэхийг идэвхжүүлсэн. Хөрс нэмэхийн өмнө нэгэн төрлийн байдлыг хангахын тулд бүх колбны агууламжийг сайтар хольсон. Дараа нь эмгэг төрүүлэгчдийн тогтмол концентрацийг хангахын тулд сав бүрт 100 г колоничлох хивэгний холимог нэмсэн. Мөөгөнцрийн өсөлтийг идэвхжүүлэхийн тулд тарьсан савнуудыг усалж, хүлэмжийн нөхцөлд 7 хоног байрлуулсан.
Дараа нь Giza 3 сортын таван үрийг сав бүрт тарьсан. L-орнитин болон Rizolex-T мөөгөнцөртэй саванд ариутгасан үрийг эхлээд хоёр нэгдлийн усан уусмалд тус тус ойролцоогоор 250 мг/л ба 50 мг/л эцсийн IC99 концентрацитай хоёр цагийн турш дэвтээж, дараа нь тариалахаас өмнө нэг цагийн турш агаарт хатаасан. Нөгөөтэйгүүр, үрийг сөрөг хяналтын хувьд ариутгасан нэрмэл усанд дэвтээсэн. 10 хоногийн дараа, анхны усалгааны өмнө суулгацыг сийрэгжүүлж, сав бүрт зөвхөн хоёр цэвэр суулгац үлдээсэн. Нэмж дурдахад, S. sclerotiorum-ийн халдварыг баталгаажуулахын тулд ижил хөгжлийн үе шатанд (10 хоног) байгаа шошны ургамлын ишийг ариутгасан хуйх ашиглан хоёр өөр газарт тайрч, ойролцоогоор 0.5 г колоничлох хивэгний хольцыг шарх бүрт хийж, дараа нь өндөр чийгшилтэй болгож, бүх тарьсан ургамалд халдвар, өвчний хөгжлийг өдөөсөн. Хяналтын ургамлуудыг мөн адил шархлуулж, өвчний хөгжлийн орчныг дуурайлган, эмчилгээний бүлгүүдийн хоорондын уялдаа холбоог хангахын тулд шарханд тэнцүү хэмжээний (0.5 г) ариутгасан, колоничлогдоогүй хивэгний холимог хийж, өндөр чийгшилтэй орчинд хадгалсан.
Эмчилгээний арга: Шошны суулгацыг хөрсийг усалж 500 мл L-орнитин (250 мг/л) усан уусмал эсвэл Rizolex-T фунгицид (50 мг/л)-аар усалж, дараа нь эмчилгээг 10 хоногийн зайтай гурван удаа давтан хийсэн. Плацебогоор эмчилсэн хяналтын сортуудыг 500 мл ариутгасан нэрмэл усаар усалсан. Бүх эмчилгээг хүлэмжийн нөхцөлд (25 ± 2°C, 75 ± 1% харьцангуй чийгшил, 8 цаг гэрэлтэй/16 цаг харанхуй фотопериод) хийсэн. Бүх савыг хоёр долоо хоног тутамд усалж, сар бүр тэнцвэржүүлсэн NPK бордоогоор (20-20-20, 3.6% хүхэр болон TE микроэлементүүдтэй; Zain Seeds, Egypt) тодорхой сортын зөвлөмж болон үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу 3-4 г/л концентрацитай навчаар шүршиж боловсруулсан. Өөрөөр заагаагүй бол бүрэн сунасан боловсорсон навчнуудыг (дээрээс нь 2 ба 3-р навч) биологийн хуулбар бүрээс боловсруулснаас хойш 72 цагийн дараа (hpt) цуглуулж, нэгэн төрлийн болгож, нэгтгэж, -80 °C-д хадгалж, исэлдэлтийн стрессийн индикаторуудын гистохимийн байршил, липидийн хэт исэлдэлт, ферментийн болон ферментийн бус антиоксидантууд болон генийн экспресс зэрэг цаашдын шинжилгээнд зориулж хадгалсан.
Цагаан хөгцний халдварын эрчимийг вакцинжуулалтаас хойш 21 хоногийн дараа (dpi) долоо хоног бүр үнэлсэн бөгөөд үүнийг Petzoldt болон Dickson-ы шатлал (1996) дээр үндэслэн 1-9 (Нэмэлт Хүснэгт S2) ашиглан Теран болон бусад (2006) өөрчилсөн. Товчхондоо, шошны ургамлын иш, мөчрийг вакцинжуулалтын цэгээс эхлэн зангилаа хоорондын болон зангилааны дагуух гэмтлийн явцыг ажигласан. Дараа нь гэмтлийн цэгээс иш эсвэл мөчрийн дагуух хамгийн алслагдсан цэг хүртэлх зайг хэмжиж, гэмтлийн байршлыг үндэслэн 1-9 оноо өгсөн бөгөөд (1) вакцинжуулалтын цэгийн ойролцоо харагдахуйц халдвар байхгүй, (2-9) гэмтлийн хэмжээ аажмаар нэмэгдэж, зангилаа/зангилаа хоорондын дагуух явц ажиглагдсан (Нэмэлт Хүснэгт S2). Дараа нь цагаан хөгцний халдварын эрчимийг 2-р томъёог ашиглан хувь болгон хөрвүүлсэн:
Үүнээс гадна, өвчний явцын муруйн доорх талбайг (AUDPC) 3-р тэгшитгэлийг ашиглан энгийн шошны цагаан ялзралд тохируулан саяхан боловсруулсан томъёо (Shaner and Finney, 1977) ашиглан тооцоолсон:
Энд Yi = ti хугацааны өвчний хүндрэл, Yi+1 = дараагийн хугацааны өвчний хүндрэл ti+1, ti = анхны хэмжилтийн цаг (хоногт), ti+1 = дараагийн хэмжилтийн цаг (хоногт), n = нийт цагийн цэг эсвэл ажиглалтын цэгүүдийн тоо. Ургамлын өндөр (см), ургамал тус бүрийн мөчрийн тоо, ургамал тус бүрийн навчны тоо зэрэг шошны ургамлын өсөлтийн параметрүүдийг бүх биологийн давталтаар 21 хоногийн турш долоо хоног бүр бүртгэсэн.
Биологийн хуулбар бүрт навчны дээжийг (дээд талаасаа хоёр дахь ба гурав дахь бүрэн хөгжсөн навч) боловсруулалтын дараах 45 дахь өдөр (сүүлийн боловсруулалтаас хойш 15 хоногийн дараа) цуглуулсан. Биологийн хуулбар бүр таван савнаас (саванд хоёр ургамал) бүрдсэн. Буталсан эдээс ойролцоогоор 500 мг-ийг 80% ацетоныг харанхуйд 4°C-д ашиглан фотосинтезийн пигментүүд (хлорофилл а, хлорофилл б ба каротиноидууд) гаргаж авахад ашигласан. 24 цагийн дараа дээжийг центрифугээр ялгаж, хлорофилл а, хлорофилл б ба каротиноидын агууламжийг (Лихтенталер, 1987) аргаар UV-160A спектрофотометр (Шимадзу корпораци, Япон) ашиглан колориметрийн аргаар тодорхойлохын тулд дээд давхаргыг цуглуулж, гурван өөр долгионы уртад (A470, A646 ба A663 нм) шингээлтийг хэмжсэн. Эцэст нь фотосинтезийн пигментүүдийн агууламжийг Лихтенталер (1987)-ийн тайлбарласан дараах 4-6 томъёог ашиглан тооцоолсон.
Боловсруулалтын дараа 72 цагийн дараа (hpt) устөрөгчийн хэт исэл (H2O2) болон супероксидын анион (O2•−)-ийн гистохимийн байршлыг тогтоохын тулд биологийн хуулбар бүрээс навч (дээрээс нь хоёр дахь болон гурав дахь бүрэн хөгжсөн навч) цуглуулсан. Биологийн хуулбар бүр таван савнаас (саванд хоёр ургамал) бүрдсэн. Аргын нарийвчлал, найдвартай байдал, давтагдах чадварыг баталгаажуулахын тулд биологийн хуулбар бүрийг давхардсан (хоёр техникийн хуулбар) шинжилсэн. H2O2 болон O2•−-г тус тус 0.1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Герман) эсвэл нитроцэнхэр тетразолиум (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Герман) ашиглан бага зэргийн өөрчлөлттэй Ромеро-Пуэртас болон бусад (2004), Адам болон бусад (1989) нарын тайлбарласан аргуудын дагуу тодорхойлсон. H2O2-ийн гистохимийн байршлыг тогтоохын тулд навчнуудыг 10 мМ Трис буферт (рН 7.8) 0.1% DAB-аар вакуум орчинд нэвчиж, дараа нь өрөөний температурт гэрэлд 60 минут инкубацлав. Навчнуудыг 4:1 (v/v) этанол:хлороформд (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) 0.15% (v/v) TCA-д цайруулж, дараа нь харанхуй болтол гэрэлд ил гаргав. Үүнтэй адилаар хавхлагуудыг O2•−-ийн гистохимийн байршлыг тогтоохын тулд 0.1 w/v % HBT агуулсан 10 мМ калийн фосфатын буфер (рН 7.8)-аар вакуум орчинд нэвчиж байв. Навчнуудыг өрөөний температурт гэрэлд 20 минут инкубацлаж, дээр дурдсанчлан цайруулж, дараа нь хар хөх/ягаан толбо гарч иртэл гэрэлтүүлэв. Үр дүнд үүссэн бор (H2O2 индикатор болгон) эсвэл хөх-ягаан (O2•− индикатор болгон) өнгөний эрчмийг дүрс боловсруулах ImageJ багцын Фижи хувилбарыг ашиглан үнэлсэн (http://fiji.sc; 2024 оны 3-р сарын 7-нд хандсан).
Малониальдегид (MDA; липидийн хэт исэлдэлтийн маркер болгон)-ийг Ду болон Брамлаж (1992)-ын аргаар бага зэрэг өөрчлөлт оруулан тодорхойлсон. Биологийн хуулбар бүрээс (дээрээс нь хоёр дахь болон гурав дахь бүрэн хөгжсөн навч) навчийг боловсруулснаас хойш 72 цагийн дараа (hpt) цуглуулсан. Биологийн хуулбар бүр таван савтай (саванд хоёр ургамал) байсан. Аргын нарийвчлал, найдвартай байдал, давтагдах чадварыг хангахын тулд биологийн хуулбар бүрийг давхардсан (хоёр техникийн хуулбар) шинжилсэн. Товчхондоо, 0.01% бутилжуулсан гидрокситолуол (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) агуулсан 20% трихлорцууны хүчил (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)-тай хамт MDA хандлахад 0.5 г нунтагласан навчны эдийг ашигласан. Дараа нь дээд давхарга дахь MDA-ийн агууламжийг UV-160A спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япон) ашиглан 532 ба 600 нм-ийн гэрэл шингээлтийг хэмжиж колориметрийн аргаар тодорхойлж, дараа нь нмоль g−1 FW гэж илэрхийлсэн.
Ферментийн бус болон ферментийн антиоксидантуудыг үнэлэхийн тулд биологийн хуулбар бүрээс навч (дээрээс нь хоёр дахь болон гурав дахь бүрэн хөгжсөн навч)-ыг боловсруулснаас хойш 72 цагийн дараа (hpt) цуглуулсан. Биологийн хуулбар бүр таван савнаас (саванд хоёр ургамал) бүрдсэн. Биологийн дээж бүрийг давхардсан байдлаар шинжилсэн (хоёр техникийн дээж). Хоёр навчийг шингэн азотоор нунтаглаж, ферментийн болон ферментийн бус антиоксидантууд, нийт амин хүчлүүд, пролины агууламж, генийн экспресс, оксалатын тоон үзүүлэлтийг тодорхойлоход шууд ашигласан.
Нийт уусдаг фенолыг Кахконен болон бусад (1999)-ын тайлбарласан аргыг бага зэрэг өөрчилснөөр Фолин-Чиокалтеу урвалж (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ашиглан тодорхойлсон. Товчхондоо, ойролцоогоор 0.1 г нэгэн төрлийн навчны эдийг 20 мл 80% метанолоор харанхуйд 24 цагийн турш хандалж, центрифугийн дараа дээд давхаргыг цуглуулсан. Дээжийн хандны 0.1 мл-ийг 0.5 мл Фолин-Чиокалтеу урвалж (10%)-тай хольж, 30 секундын турш сэгсэрч, харанхуйд 5 минут байлгасан. Дараа нь хуруу шил бүрт 0.5 мл 20% натрийн карбонатын уусмал (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каир, Египет) нэмж, сайтар хольж, өрөөний температурт харанхуйд 1 цагийн турш инкубацлав. Инкубацийн дараа урвалын хольцын шингээлтийг 765 нм-т UV-160A спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япон) ашиглан хэмжсэн. Дээжийн ханд дахь нийт уусдаг фенолын концентрацийг галлийн хүчлийн тохируулгын муруй (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ашиглан тодорхойлж, шинэхэн жингийн нэг грамм тутамд галлийн хүчлийн эквивалент миллиграмм (мг GAE g-1 шинэхэн жин) гэж илэрхийлсэн.
Нийт уусдаг флавоноидын агууламжийг бага зэрэг өөрчлөлттэйгөөр Джеридан болон бусад (2006) аргын дагуу тодорхойлсон. Товчхондоо, дээрх метанолын хандыг 0.3 мл 5% хөнгөн цагааны хлоридын уусмал (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптон, NH, АНУ)-тай хольж, хүчтэй хутгаж, дараа нь өрөөний температурт 5 минут инкубацлаж, дараа нь 0.3 мл 10% калийн ацетатын уусмал (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) нэмж, сайтар хольж, өрөөний температурт 30 минут харанхуйд инкубацлав. Инкубацийн дараа урвалын хольцын шингээлтийг 430 нм-т UV-160A спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япон) ашиглан хэмжсэн. Дээжийн ханд дахь нийт уусдаг флавоноидын концентрацийг рутины тохируулгын муруй (TCI America, Portland, OR, USA) ашиглан тодорхойлж, дараа нь шинэхэн жингийн нэг грамм тутамд рутин эквивалент миллиграмм (мг RE g-1 шинэхэн жин) гэж илэрхийлсэн.
Шошны навчны нийт чөлөөт амин хүчлийн агууламжийг Ёкояма, Хираматсу (2003) нарын санал болгосон, Сун нар (2006)-ын өөрчилсөн аргад үндэслэн өөрчилсөн нингидрин урвалж (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ашиглан тодорхойлсон. Товчхондоо, 0.1 г нунтагласан эдийг рН 5.4 буферээр гаргаж авсан бөгөөд 200 мкл дээд давхаргыг 200 мкл нингидрин (2%) болон 200 мкл пиридин (10%; Spectrum Chemical, Нью Брунсвик, Нью Жерси, USA)-тай урвалд оруулж, буцалж буй усан ваннд 30 минут байлгаж, дараа нь хөргөөд UV-160A спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япон) ашиглан 580 нм-т хэмжсэн. Нөгөөтэйгүүр, пролиныг Бэйтсийн аргаар тодорхойлсон (Бэйтс нар, 1973). Пролиныг 3% сульфосалицилын хүчил (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)-аар гаргаж авсан бөгөөд центрифугийн дараа 0.5 мл дээд давхаргыг 1 мл мөсөн цууны хүчил (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) болон нингидрин урвалжтай хольж, 90°C-д 45 минут инкубацлаж, хөргөж, дээрхтэй ижил спектрофотометр ашиглан 520 нм-т хэмжсэн. Навчны ханд дахь нийт чөлөөт амин хүчил ба пролиныг тус тус глицин ба пролины тохируулгын муруй (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ашиглан тодорхойлж, мг/г шинэ жингээр илэрхийлсэн.
Антиоксидант ферментийн ферментийн идэвхийг тодорхойлохын тулд ойролцоогоор 500 мг гомогенжүүлсэн эдийг 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АНУ) болон 7.5% поливинилпирролидон (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АНУ) агуулсан 3 мл 50 мМ Трис буфер (рН 7.8)-аар гаргаж авч, хөргөгчинд (4°C) 20 минутын турш 10,000 × g-д центрифугээр ялгаж, дээд давхаргыг (түүхий ферментийн ханд) цуглуулсан (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Дараа нь каталаза (CAT)-ийг 2 мл 0.1 М натрийн фосфатын буфер (рН 6.5; Сигма-Алдрих, Сент-Луис, Миссури, АНУ) болон 100 мкл 269 мМ H2O2 уусмалаар урвалд оруулж, түүний ферментийн идэвхийг бага зэрэг өөрчлөлттэй Aebi (1984) аргаар тодорхойлсон (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Гуайаколоос хамааралтай пероксидазын (POX) ферментийн идэвхийг Харрах et al. (2009) аргаар тодорхойлсон. (2008) бага зэргийн өөрчлөлттэй (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) болон полифенол оксидазын (PPO) ферментийн идэвхийг 2.2 мл 100 мМ натрийн фосфатын буфер (рН 6.0), 100 мкл гуайакол (TCI chemicals, Портланд, Орегон, АНУ) болон 100 мкл 12 мМ H2O2-той урвалд орсны дараа тодорхойлсон. Энэ аргыг (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023)-аас бага зэрэг өөрчилсөн. Шинжилгээг 0.1 М фосфатын буфер (рН 6.0)-д шинээр бэлтгэсэн 3 мл катехолын уусмал (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M)-тай урвалд орсны дараа гүйцэтгэсэн. CAT идэвхжилийг 240 нм (A240) долгионы уртад H2O2-ийн задралыг хянах замаар, POX идэвхжилийг 436 нм (A436) долгионы уртад шингээлтийн өсөлтийг хянах замаар, PPO идэвхжилийг UV-160A спектрофотометр (Шимадзу, Япон) ашиглан 30 секунд тутамд 495 нм (A495) долгионы уртад шингээлтийн хэлбэлзлийг 3 минутын турш бүртгэх замаар хэмжсэн.
Сүүлийн боловсруулалтаас хойш 72 цагийн дараа шошны навч (дээрээс нь хоёр дахь болон гурав дахь бүрэн хөгжсөн навч)-д пероксисомаль каталаза (PvCAT1; GenBank Accesstion № KF033307.1), супероксид дисмутаза (PvSOD; GenBank Accesstion № XM_068639556.1) болон глутатион редуктаза (PvGR; GenBank Accesstion № KY195009.1) зэрэг антиоксиданттай холбоотой гурван генийн транскрипцийн түвшинг илрүүлэхэд бодит цагийн RT-PCR ашигласан. Товчхондоо, үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Хятад) ашиглан РНХ-г ялгасан. Дараа нь үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу TOP script™ cDNA Synthesis Kit ашиглан кДНХ-г нийлэгжүүлсэн. Дээрх гурван генийн праймерын дарааллыг Нэмэлт Хүснэгт S3-т жагсаасан болно. PvActin-3 (GenBank-ийн бүртгэлийн дугаар: XM_068616709.1)-ийг гэрийн ажил эрхлэлтийн ген болгон ашигласан бөгөөд харьцангуй генийн экспрессийг 2-ΔΔCT аргаар тооцоолсон (Livak болон Schmittgen, 2001). Биотик стресс (нийтлэг буурцагт ургамал болон антракнозын мөөгөнцөр Colletotrichum lindemuthianum-ийн хоорондын үл нийцэх харилцан үйлчлэл) болон абиотик стресс (ган гачиг, давсжилт, бага температур)-ийн дор актины тогтвортой байдлыг харуулсан (Borges et al., 2012).
Бид анх S. sclerotiorum-д агуулагдах оксалоацетат ацетилгидролаза (OAH) уургуудын геномын цахиурын шинжилгээг уураг-уургийн BLAST хэрэгсэл (BLASTp 2.15.0+) ашиглан хийсэн (Altschul et al., 1997, 2005). Товчхондоо, бид Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank-ийн бүртгэлийн дугаар XP_040799428.1; 342 амин хүчил) болон Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank-ийн бүртгэлийн дугаар XP_056833920.1; 316 амин хүчил)-ийг асуулга дараалал болгон ашигласан. S. sclerotiorum-д агуулагдах гомолог уургийг (таксид: 5180) зураглах. BLASTp-г Биотехнологийн мэдээллийн үндэсний төвийн (NCBI) вэбсайт http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ дээрх GenBank дахь хамгийн сүүлд гарсан S. sclerotiorum геномын өгөгдөлтэй харьцуулан хийсэн.
Үүнээс гадна, S. sclerotiorum-оос таамагласан OAH ген (SsOAH) болон A. fijiensis CBS 313.89-аас AfOAH болон P. lagena-аас PlOAH-ийн хувьслын шинжилгээ болон филогенетик модыг MEGA11 (Tamura et al., 2021) болон JTT матриц дээр суурилсан загвар (Jones et al., 1992) дахь хамгийн их магадлалын аргыг ашиглан гаргасан. Филогенетик модыг S. sclerotiorum-оос таамагласан бүх OAH генийн (SsOAH) уургийн дарааллын олон тохируулгын шинжилгээ болон Хязгаарлалтад суурилсан тохируулгын хэрэгсэл (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) ашиглан асуулгын дараалалтай хослуулсан (Papadopoulos болон Agarwala, 2007). Үүнээс гадна, S. sclerotiorum-аас гаргаж авсан SsOAH-ийн хамгийн сайн тохирох амин хүчлийн дарааллыг ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) ашиглан асуулгын дараалал (AfOAH ба PlOAH) (Larkin et al., 2007)-тай уялдуулсан бөгөөд уялдуулсан хэсэгт хадгалагдсан бүс нутгуудыг ESPript хэрэгсэл (3.0 хувилбар; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) ашиглан дүрслэн харуулсан.
Цаашилбал, S. sclerotiorum SsOAH-ийн таамагласан функциональ төлөөллийн домэйн болон хадгалагдсан газруудыг InterPro хэрэгслийг ашиглан өөр өөр бүлд интерактив байдлаар ангилсан (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Эцэст нь таамагласан S. sclerotiorum SsOAH-ийн гурван хэмжээст (3D) бүтцийн загварчлалыг Protein Homology/Anallogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ашиглан гүйцэтгэж, SWISS-MODEL сервер (https://swissmodel.expasy.org/) ашиглан баталгаажуулсан (Biasini et al., 2014). Урьдчилан таамагласан гурван хэмжээст бүтцийг (PDB формат) UCSF-Chimera багц (хувилбар 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) ашиглан интерактив байдлаар дүрслэн харуулсан (Петтерсен нар, 2004).
Sclerotinia sclerotiorum-ийн мицелид оксалоацетатын ацетилгидролазын (SsOAH; GenBank нэвтрэх дугаар: XM_001590428.1) транскрипцийн түвшинг тодорхойлохын тулд тоон бодит цагийн флуоресценцийн ПГУ-г ашигласан. Товчхондоо, S. sclerotiorum-ийг PDB агуулсан колбонд тарьж, сэгсрэгч инкубаторт (загвар: I2400, Нью Брунсвик Шинжлэх Ухааны Ко., Эдисон, Нью Жерси, АНУ) 25 ± 2 °C температурт 24 цагийн турш 150 эрг/мин-ээр, тогтмол харанхуйд (24 цаг) байрлуулж, мицелийн өсөлтийг идэвхжүүлсэн. Үүний дараа эсүүдийг эцсийн IC50 концентрацид (ойролцоогоор 40 ба 3.2 мг/л тус тус) L-орнитин болон фунгицид Rizolex-T-ээр боловсруулж, дараа нь ижил нөхцөлд дахин 24 цагийн турш өсгөвөрлөв. Инкубацийн дараа өсгөврийг 2500 эрг/мин хурдтайгаар 5 минутын турш центрифугээр түлж, генийн экспрессийн шинжилгээнд зориулж дээд давхаргыг (мөөгний мицели) цуглуулсан. Үүнтэй адил халдвар авсан эд эсийн гадаргуу дээр цагаан хөгц, хөвөн мицели үүссэн халдвар авсан ургамлаас халдвар авснаас хойш 0, 24, 48, 72, 96, 120 цагийн дараа мөөгөнцрийн мицелийг цуглуулсан. Мөөгөнцрийн мицелиас РНХ гаргаж аваад дараа нь дээр дурдсанчлан кДНХ-ийг нэгтгэсэн. SsOAH-ийн праймерын дарааллыг S3 нэмэлт хүснэгтэд жагсаасан болно. SsActin (GenBank нэвтрэх дугаар: XM_001589919.1)-ийг гэрийн ажил эрхлэлтийн ген болгон ашигласан бөгөөд харьцангуй генийн экспрессийг 2-ΔΔCT аргаар тооцоолсон (Livak болон Schmittgen, 2001).
Оксалийн хүчлийг төмсний декстрозын шөл (PDB) болон мөөгөнцрийн эмгэг төрүүлэгч Sclerotinia sclerotiorum агуулсан ургамлын дээжинд бага зэрэг өөрчлөлт оруулан тодорхойлсон. Товчхондоо, S. sclerotiorum-ийн изолятуудыг PDB агуулсан колбонд тарьж, дараа нь мицелийн өсөлтийг идэвхжүүлэхийн тулд сэгсрэгч инкубаторт (I2400 загвар, Нью Брунсвик Шинжлэх Ухааны Ко, Эдисон, Нью Жерси, АНУ) 150 эрг/мин-т 25 ± 2 °C-т 3-5 хоногийн турш тогтмол харанхуйд (24 цаг) өсгөвөрлөв. Инкубацийн дараа мөөгөнцрийн өсгөврийг эхлээд Whatman #1 шүүлтүүрийн цаасаар шүүж, дараа нь үлдэгдэл мицелийг арилгахын тулд 2500 эрг/мин-т 5 минутын турш центрифугээр түлхэв. Дээд давхаргыг цуглуулж, оксалатын тоон үзүүлэлтийг цаашид тодорхойлохын тулд 4°C-т хадгалав. Ургамлын дээж бэлтгэхийн тулд ойролцоогоор 0.1 г ургамлын эдийн хэлтэрхийг нэрмэл усаар гурван удаа (тус бүр 2 мл) гаргаж авсан. Дараа нь дээжийг 2500 эрг/мин хурдтайгаар 5 минутын турш центрифугээр ялгаж, дээд давхаргыг Whatman №1 шүүлтүүрийн цаасаар хуурай шүүж, цаашдын шинжилгээнд зориулж цуглуулсан.
Оксалийн хүчлийн тоон шинжилгээнд урвалын хольцыг шилэн бөглөөтэй хоолойд дараах дарааллаар бэлтгэсэн: 0.2 мл дээж (эсвэл PDB өсгөврийн шүүлтүүр эсвэл оксалийн хүчлийн стандарт уусмал), 0.11 мл бромфенолын хөх (BPB, 1 мМ; Фишер Химикаль, Питтсбург, Пенсильвани, АНУ), 0.198 мл 1 М хүхрийн хүчил (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) болон 0.176 мл 100 мМ калийн дихромат (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портланд, Орегон, АНУ), дараа нь уусмалыг нэрмэл усаар 4.8 мл хүртэл шингэлж, эрчимтэй хольж, 60°C усан ваннд нэн даруй байрлуулсан. 10 минутын дараа 0.5 мл натрийн гидроксидын уусмал (NaOH; 0.75 М) нэмж урвалыг зогсоосон. Урвалын хольцын шингээлтийг (A600) 600 нм-т UV-160 спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Япон) ашиглан хэмжсэн. Өсгөврийн шүүлтүүр болон ургамлын дээжийг тоон үзүүлэлт болгон тус тус PDB болон нэрмэл усыг ашигласан. Өсгөврийн шүүлтүүр дэх оксалийн хүчлийн концентрацийг PDB орчны миллилитр тутамд оксалийн хүчлийн микрограмм (μg.mL−1), навчны ханд дахь оксалийн хүчлийн концентрацийг шинэ жингийн нэг грамм тутамд оксалийн хүчлийн микрограмм (μg.g−1 FW) гэж илэрхийлсэн бөгөөд оксалийн хүчлийн тохируулгын муруй (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ашиглан тодорхойлсон.
Судалгааны туршид бүх туршилтыг бүрэн санамсаргүй байдлаар (CRD) боловсруулсан бөгөөд өөрөөр заагаагүй бол эмчилгээ бүрт зургаан биологийн давталт, биологийн давталт бүрт таван сав (саванд хоёр ургамал) хийсэн. Биологийн давталтуудыг давхардсан байдлаар шинжилсэн (хоёр техникийн давталт). Техникийн давталтуудыг ижил туршилтын давтагдах чадварыг шалгахад ашигласан боловч хуурамч давталтаас зайлсхийхийн тулд статистикийн шинжилгээнд ашиглаагүй болно. Өгөгдлийг дисперсийн шинжилгээ (ANOVA), дараа нь Туки-Крамерын үнэн зөв ач холбогдолтой ялгаа (HSD) тест (p ≤ 0.05) ашиглан статистикийн шинжилгээ хийсэн. In vitro туршилтын хувьд IC50 ба IC99 утгыг пробит загварыг ашиглан тооцоолж, 95%-ийн итгэлцлийн интервалыг тооцоолсон.
Египетийн Эль-Габия мужийн өөр өөр шар буурцгийн талбайгаас нийт дөрвөн изолят цуглуулсан. PDA орчинд бүх изолятууд нь өтгөн цагаан мицели үүсгэсэн бөгөөд энэ нь хурдан хөвөн шиг цагаан болж хувирсан (Зураг 1A), дараа нь склеротиумын үе шатанд шаргал эсвэл хүрэн өнгөтэй болсон. Склеротиум нь ихэвчлэн нягт, хар, бөмбөрцөг хэлбэртэй эсвэл жигд бус хэлбэртэй, 5.2-7.7 мм урт, 3.4-5.3 мм диаметртэй байдаг (Зураг 1B). Хэдийгээр дөрвөн изолят нь 25 ± 2 °C-д 10-12 хоногийн турш инкубацийн дараа өсгөврийн орчны ирмэг дээр склеротиумын захын хэв маягийг бий болгосон ч (Зураг 1A), хавтан дахь склеротиумын тоо тэдгээрийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан (P < 0.001), 3-р изолят нь хамгийн их склеротиумтай байсан (хавтан дахь 32.33 ± 1.53 склеротиум; Зураг 1C). Үүнтэй адилаар, #3 тусгаарлагч нь PDB-д бусад тусгаарлагчаас илүү их оксалийн хүчил үүсгэсэн (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; Зураг 1D). #3 тусгаарлагч нь фитопатоген мөөгөнцөр Sclerotinia sclerotiorum-ийн ердийн морфологи ба микроскопийн шинж чанарыг харуулсан. Жишээлбэл, PDA дээр #3 тусгаарлагчийн колони хурдан ургаж, цөцгий цагаан (Зураг 1A), урвуу шаргал эсвэл цайвар хулд загас шар-бор өнгөтэй байсан бөгөөд 9 см диаметртэй хавтангийн гадаргууг бүрэн бүрхэхэд 25 ± 2°C-д 6-7 хоног шаардлагатай байв. Дээрх морфологи ба микроскопийн шинж чанарууд дээр үндэслэн #3 тусгаарлагчийг Sclerotinia sclerotiorum гэж тодорхойлсон.
Зураг 1. Нийтлэг буурцагт ургамлын таримал ургамлын S. sclerotiorum-ийн тусгаарлагчийн шинж чанар ба эмгэг төрүүлэгч чанар. (A) PDA орчинд дөрвөн S. sclerotiorum тусгаарлагчийн мицелийн өсөлт, (B) дөрвөн S. sclerotiorum тусгаарлагчийн склеротиа, (C) склеротиудын тоо (тавган дээр), (D) PDB орчинд оксалийн хүчлийн шүүрэл (μg.mL−1), болон (E) хүлэмжийн нөхцөлд мэдрэмтгий арилжааны буурцагт ургамлын сорт Giza 3 дээр дөрвөн S. sclerotiorum тусгаарлагчийн өвчний хүндийн зэрэг (%). Утгууд нь таван биологийн давталтын дундаж ± SD-г илэрхийлнэ (n = 5). Өөр өөр үсэг нь эмчилгээний хооронд статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (p < 0.05). (F–H) 3-р тусгаарлагч (dpi)-аар тарьснаас хойш 10 хоногийн дараа цагаан хөгцний ердийн шинж тэмдэг газрын дээрх иш болон силика дээр тус тус гарч ирсэн. (I) S. sclerotiorum #3 тусгаарлагчийн дотоод транскрипцлэгдсэн зай хураагуур (ITS) бүсийн хувьслын шинжилгээг хамгийн их магадлалын аргыг ашиглан хийж, Биотехнологийн мэдээллийн үндэсний төвийн (NCBI) мэдээллийн сангаас (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) авсан 20 лавлагаа тусгаарлагч/омогтой харьцуулсан. Кластерын шугамын дээрх тоонууд нь бүсийн хамрах хүрээг (%), кластерын шугамын доорх тоонууд нь мөчрийн уртыг заана.
Цаашилбал, эмгэг төрүүлэгч чанарыг баталгаажуулахын тулд хүлэмжийн нөхцөлд мэдрэмтгий арилжааны шошны сорт болох Гиза 3-ыг тарихад олж авсан дөрвөн S. sclerotiorum изолятыг ашигласан бөгөөд энэ нь Кохын постулатуудтай нийцэж байна (Зураг 1E). Олж авсан бүх мөөгөнцрийн изолятууд нь эмгэг төрүүлэгч бөгөөд ногоон шошыг халдварлуулж (cv. Giza 3), тарьснаас хойш 10 хоногийн дараа (dpi) газрын дээрх бүх хэсэгт (Зураг 1F), ялангуяа иш (Зураг 1G) болон хонхорцог (Зураг 1H) дээр цагаан хөгцний ердийн шинж тэмдэг үүсгэж болох боловч 3-р изолят нь хоёр бие даасан туршилтаар хамгийн түрэмгий изолят байв. 3-р изолят нь шошны ургамал дээр өвчний хамгийн өндөр хүндрэлтэй (%) байсан (халдварын дараа 7, 14, 21 хоногийн дараа тус тус 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, 76.7 ± 3.1; Зураг 1F).
Хамгийн инвазив S. sclerotiorum тусгаарлагч #3-ыг тодорхойлсон нь дотоод транскрипцийн зай (ITS) дарааллын үндсэн дээр цаашид батлагдсан (Зураг 1I). 3-р тусгаарлагч болон 20 лавлагаа тусгаарлагч/омгийн хоорондох филогенетикийн шинжилгээгээр тэдгээрийн хооронд өндөр ижил төстэй байдал (>99%) ажиглагдсан. S. sclerotiorum тусгаарлагч #3 (533 bp) нь хуурай вандуйны үрээс ялгасан Америкийн S. sclerotiorum тусгаарлагч LPM36 (GenBank бүртгэлийн дугаар MK896659.1; 540 bp) болон Хятадын S. sclerotiorum тусгаарлагч YKY211 (GenBank бүртгэлийн дугаар OR206374.1; 548 bp)-тай өндөр ижил төстэй болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй бөгөөд энэ нь нил ягаан (Matthiola incana) ишний ялзрал үүсгэдэг бөгөөд эдгээр нь бүгд дендрограммын дээд хэсэгт тусад нь бүлэглэгдсэн байдаг (Зураг 1I). Шинэ дарааллыг NCBI мэдээллийн санд хадгалж, “Sclerotinia sclerotiorum – YN-25 тусгаарлалт” (GenBank бүртгэлийн дугаар PV202792) гэж нэрлэсэн. 3-р тусгаарлалт нь хамгийн инвазив тусгаарлалт гэдгийг харж болно; тиймээс энэ тусгаарлалтыг дараагийн бүх туршилтуудад судалгаанд сонгосон.
Диамин L-орнитин (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Герман)-ийн S. sclerotiorum изолят 3-ын эсрэг янз бүрийн концентрацид (12.5, 25, 50, 75, 100 ба 125 мг/л) нянгийн эсрэг идэвхжилийг in vitro нөхцөлд судалсан. L-орнитин нь нянгийн эсрэг үйлчилгээ үзүүлж, тунгаас хамааралтай байдлаар S. sclerotiorum hyphae-ийн радиаль өсөлтийг аажмаар дарангуйлдаг болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй (Зураг 2A, B). Туршилтын хамгийн өндөр концентрацид (125 мг/л) L-орнитин нь мицелийн өсөлтийг дарангуйлах хамгийн өндөр хурдыг (99.62 ± 0.27%; Зураг 2B) харуулсан бөгөөд энэ нь туршилтын хамгийн өндөр концентрацид (10 мг/л) арилжааны фунгицид Rizolex-T-тэй тэнцүү (дарангуйлах хурд 99.45 ± 0.39%; Зураг 2C) байсан нь ижил төстэй үр нөлөөг харуулж байна.
Зураг 2. L-орнитины Sclerotinia sclerotiorum-ийн эсрэг in vitro бактерийн эсрэг үйлчилгээ. (A) L-орнитины S. sclerotiorum-ийн эсрэг янз бүрийн концентрацийн бактерийн эсрэг үйлчлэлийг арилжааны фунгицид Rizolex-T (10 мг/л)-тэй харьцуулсан байдал. (B, C) L-орнитины (12.5, 25, 50, 75, 100 ба 125 мг/л) эсвэл Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ба 10 мг/л) өөр өөр концентрацитай эмчилгээний дараа S. sclerotiorum-ийн мицелийн өсөлтийг дарангуйлах түвшин (%) тус тус. Утгууд нь таван биологийн давталтын дундаж ± SD-г илэрхийлнэ (n = 5). Өөр өөр үсэг нь эмчилгээний хоорондох статистикийн ялгааг илэрхийлнэ (p < 0.05). (D, E) L-орнитин ба арилжааны фунгицид Rizolex-T-ийн пробит загварын регрессийн шинжилгээ тус тус. Пробит загварын регрессийн шугамыг цэнхэр шугамаар, итгэлцлийн интервалыг (95%) тасархай улаан шугамаар харуулав.
Үүнээс гадна, пробит регрессийн шинжилгээг хийсэн бөгөөд харгалзах графикуудыг Хүснэгт 1 болон Зураг 2D, E-д үзүүлэв. Товчхондоо, L-орнитины хүлээн зөвшөөрөгдөх налуугийн утга (y = 2.92x − 4.67) болон холбогдох чухал статистикууд (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ба p < 0.0001; Зураг 2D) нь арилжааны мөөгөнцөр Rizolex-T-тэй харьцуулахад S. sclerotiorum-ийн эсрэг мөөгөнцрийн эсрэг үйлчилгээ сайжирсан болохыг харуулж байна (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ба p < 0.0001) (Хүснэгт 1).
Хүснэгт 1. S. sclerotiorum-ийн эсрэг L-орнитин ба арилжааны фунгицид болох "Rizolex-T"-ийн хагас хамгийн их дарангуйлах концентраци (IC50) ба IC99 (мг/л)-ийн утгууд.
Ерөнхийдөө L-орнитин (250 мг/л) нь эмчлээгүй S. sclerotiorum-оор халдварласан ургамалтай харьцуулахад эмчилсэн нийтлэг шошны ургамал дээрх цагаан хөгцний хөгжил, хүндрэлийг мэдэгдэхүйц бууруулсан (хяналтын бүлэг; Зураг 3A). Товчхондоо, эмчлээгүй халдвар авсан хяналтын ургамлын өвчний хүндрэл аажмаар нэмэгдсэн (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ба 92.33 ± 3.06%) боловч L-орнитин нь эмчилгээний дараа 7, 14, 21 хоногийн дараа (dpt) туршилтын туршид өвчний хүндрэлийг (%) мэдэгдэхүйц бууруулсан (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ба 26.36 ± 3.07) (Зураг 3A). Үүнтэй адилаар, S. sclerotiorum-оор халдварлагдсан шошны ургамлыг 250 мг/л L-орнитиноор эмчлэхэд өвчний явцын муруйн доорх талбай (AUDPC) нь эмчлээгүй хяналтын бүлэгт 1274.33 ± 33.13-аас 281.03 ± 7.95 болж буурсан нь эерэг хяналтын бүлэгт 50 мг/л Rizolex-T фунгицидынхаас (183.61 ± 7.71; Зураг 3B) арай бага байв. Хоёр дахь туршилтад мөн адил хандлага ажиглагдсан.
Зураг. 3. Хүлэмжийн нөхцөлд Sclerotinia sclerotiorum-ийн улмаас үүссэн нийтлэг шошны цагаан ялзралын хөгжилд L-орнитиныг гадны нөлөө үзүүлэх нь. (A) 250 мг/л L-орнитиноор эмчилсний дараа нийтлэг шошны цагаан хөгцний өвчний явцын муруй. (B) L-орнитиноор эмчилсний дараа нийтлэг шошны цагаан хөгцний өвчний явцын муруйн доорх талбай (AUDPC). Утгууд нь таван биологийн давталтын дундаж ± SD-г илэрхийлнэ (n = 5). Өөр өөр үсэг нь эмчилгээний хооронд статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг илэрхийлнэ (p < 0.05).
250 мг/л L-орнитиныг гадны хэрэглээ нь 42 хоногийн дараа ургамлын өндрийг (Зураг 4A), ургамал дахь мөчрийн тоог (Зураг 4B), ургамал дахь навчны тоог (Зураг 4C) аажмаар нэмэгдүүлсэн. Худалдааны фунгицид болох Rizolex-T (50 мг/л) нь судлагдсан бүх тэжээллэг чанарын үзүүлэлтүүдэд хамгийн их нөлөө үзүүлсэн бол 250 мг/л L-орнитиныг гадны хэрэглээ нь эмчлээгүй хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад хоёрдугаарт хамгийн их нөлөө үзүүлсэн (Зураг 4A-C). Нөгөөтэйгүүр, L-орнитин эмчилгээ нь фотосинтезийн пигментүүд болох хлорофилл а (Зураг 4D) болон хлорофилл b (Зураг 4E)-ийн агууламжид мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлээгүй боловч сөрөг хяналт (0.44 ± 0.02 мг/г fr wt) болон эерэг хяналт (0.46 ± 0.02 мг/г fr wt; Зураг 4F)-тэй харьцуулахад нийт каротиноидын агууламжийг (0.56 ± 0.03 мг/г fr wt) бага зэрэг нэмэгдүүлсэн. Ерөнхийдөө эдгээр үр дүнгээс харахад L-орнитин нь боловсруулсан буурцагт ургамалд фитотоксик биш бөгөөд тэдний өсөлтийг өдөөж болно.
Зураг. 4. Хүлэмжийн нөхцөлд Sclerotinia sclerotiorum-оор халдварлагдсан шошны навчны өсөлтийн шинж чанар болон фотосинтезийн пигментүүдэд экзоген L-орнитин хэрэглэх нөлөө. (A) Ургамлын өндөр (см), (B) Ургамал дахь мөчрийн тоо, (C) Ургамал дахь навчны тоо, (D) Хлорофилл а-ийн агууламж (мг g-1 fr wt), (E) Хлорофилл b-ийн агууламж (мг g-1 fr wt), (F) Нийт каротиноидын агууламж (мг g-1 fr wt). Утгууд нь таван биологийн давталтын дундаж ± SD юм (n = 5). Өөр өөр үсэг нь эмчилгээний хооронд статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг харуулж байна (p < 0.05).
Идэвхтэй хүчилтөрөгчийн төрөл зүйлийн (ROS; устөрөгчийн хэт исэл [H2O2] гэж илэрхийлэгдсэн) болон чөлөөт радикалуудын (супероксид анион [O2•−] гэж илэрхийлэгдсэн) гистохимийн байршлыг газар дээр нь судлахад L-орнитин (250 мг/л)-ийг экзоген байдлаар хэрэглэх нь эмчлээгүй халдвар авсан ургамал (тус тус 173.31 ± 12.06 ба 149.35 ± 7.94 нмол.г−1 FW) болон 50 мг/л арилжааны Rizolex-T фунгицидээр эмчилсэн ургамал (тус тус 170.12 ± 9.50 ба 157.00 ± 7.81 нмол.г−1 fr wt)-ийн хуримтлалтай харьцуулахад H2O2 (96.05 ± 5.33 нмол.г−1 FW; Зураг 5A) болон O2•− (32.69 ± 8.56 нмол.г−1 FW; Зураг 5B)-ийн хуримтлалыг мэдэгдэхүйц бууруулсан болохыг тогтоожээ. 72 цагийн турш. Hpt-ийн дор H2O2 ба O2•− өндөр түвшинд хуримтлагдсан (Зураг 5A, B). Үүнтэй адилаар, TCA дээр суурилсан малониальдегид (MDA) шинжилгээгээр S. sclerotiorum-оор халдварлагдсан шошны ургамал навчандаа MDA-ийн өндөр түвшин (113.48 ± 10.02 нмоль.г fr wt) хуримтлагдсан болохыг харуулсан (Зураг 5C). Гэсэн хэдий ч L-орнитиныг экзоген хэрэглээ нь липидийн хэт исэлдэлтийг мэдэгдэхүйц бууруулсан бөгөөд үүнийг боловсруулсан ургамалд MDA-ийн агууламж буурсан (33.08 ± 4.00 нмоль.г fr wt) нотолж байна.
Зураг. 5. Хүлэмжийн нөхцөлд халдвар авснаас хойш 72 цагийн дараа S. sclerotiorum-оор халдварлагдсан шошны навчинд экзоген L-орнитин хэрэглэх нь исэлдэлтийн стрессийн гол тэмдэглэгээ болон ферментийн бус антиоксидант хамгаалалтын механизмд үзүүлэх нөлөө. (A) Устөрөгчийн хэт исэл (H2O2; nmol g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (B) супероксидын анион (O2•−; nmol g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (C) малониальдегид (MDA; nmol g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (D) нийт уусдаг фенол (мг GAE g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (E) нийт уусдаг флавоноид (мг RE g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (F) нийт чөлөөт амин хүчил (мг g−1 FW) 72 морины хүчтэй, (G) пролины агууламж (мг g−1 FW) 72 морины хүчтэй. Утгууд нь 5 биологийн давталтын дундаж ± стандарт хазайлтыг (дундаж ± SD) илэрхийлнэ (n = 5). Өөр өөр үсэг нь эмчилгээний хооронд статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц ялгааг заана (p < 0.05).