Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд бид танд хөтчийнхөө шинэ хувилбарыг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр Тохиромжтой байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд тасралтгүй дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид сайтыг хэв маяг эсвэл JavaScriptгүйгээр харуулж байна.
Пропионы хүчил (PPA)-г аутизмын спектрийн эмгэг зэрэг мэдрэлийн хөгжлийн эмгэгүүдэд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалын үүргийг судлахад ашигладаг. PPA нь митохондрийн биогенез, бодисын солилцоо, эргэлтийг тасалдуулдаг нь мэдэгдэж байна. Гэсэн хэдий ч PPA-ийн митохондрийн динамик, хуваагдал, нэгдэлд үзүүлэх нөлөө нь эдгээр механизмын нарийн төвөгтэй цаг хугацааны шинж чанараас шалтгаалан асуудалтай хэвээр байна. Энд бид PPA нь мэдрэлийн эсийн төст SH-SY5Y эсүүдэд митохондрийн хэт бүтэц, морфологи, динамикт хэрхэн нөлөөлдөг болохыг судлахын тулд нэмэлт тоон дүрслэлийн аргыг ашигладаг. PPA (5 мМ) нь митохондрийн талбай (p < 0.01), Феретийн диаметр ба тойрог (p < 0.05), 2-р талбай (p < 0.01)-д мэдэгдэхүйц бууралт үүсгэсэн. Митохондрийн үйл явдлын байршлын шинжилгээгээр хуваагдал ба нэгдлийн үйл явдлууд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (p < 0.05) бөгөөд ингэснээр стрессийн нөхцөлд митохондрийн сүлжээний бүрэн бүтэн байдлыг хадгалж байна. Үүнээс гадна, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) болон OPA1 (p < 0.05)-ийн mRNA экспресс мэдэгдэхүйц буурсан. 01). Энэ нь стрессийн нөхцөлд үйл ажиллагаагаа хадгалахын тулд митохондрийн морфологи, биогенез болон динамикийг дахин загварчилж байгааг харуулж байна. Бидний өгөгдөл нь PPA-ийн митохондрийн динамикт үзүүлэх нөлөөллийн талаар шинэ ойлголт өгөх бөгөөд митохондрийн стрессийн хариу урвалд оролцдог нарийн төвөгтэй зохицуулалтын механизмыг судлах дүрслэх аргын ашиг тусыг онцолж байна.
Митохондри нь энерги үйлдвэрлэх, биосинтез дэх ердийн үүргээсээ гадна эсийн янз бүрийн үйл ажиллагаанд салшгүй оролцдог. Митохондрийн солилцоо нь кальцийн дохиолол, бодисын солилцоо ба исэлдэн ангижрах гомеостаз, үрэвслийн дохиолол, эпигенетикийн өөрчлөлт, эсийн үржил, ялгарал, програмчлагдсан эсийн үхлийн гол зохицуулагч юм. Ялангуяа митохондрийн солилцоо нь мэдрэлийн эсийн хөгжил, оршин тогтнох, үйл ажиллагаанд чухал үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд мэдрэлийн эмгэг судлалын янз бүрийн илрэлд өргөнөөр оролцдог2,3,4.
Сүүлийн арван жилийн хугацаанд бодисын солилцооны төлөв байдал нь мэдрэлийн эсийн үүсэл, ялгарал, төлөвшил, уян хатан чанарын төв зохицуулагч болж гарч ирсэн5,6. Саяхан митохондрийн морфологи ба динамик нь эсийн дотор эрүүл митохондрийн санг хадгалдаг динамик үйл явц болох митозын онцгой чухал бүрэлдэхүүн хэсэг болсон. Митохондрийн динамикийг митохондрийн биогенез ба биоэнергетикээс эхлээд митохондрийн хуваагдал, нэгдэл, тээвэрлэлт, цэвэрлэгээ хүртэлх нарийн төвөгтэй харилцан хамааралтай замуудаар зохицуулдаг7,8. Эдгээр интеграцийн механизмын аль нэгийг тасалдуулах нь эрүүл митохондрийн сүлжээг хадгалахад саад болж, мэдрэлийн хөгжилд гүн гүнзгий үйл ажиллагааны үр дагаварт хүргэдэг9,10. Үнэндээ митохондрийн динамикийн зохицуулалтын алдагдал нь аутизмын спектрийн эмгэг (ASD)11,12 зэрэг олон сэтгэцийн, мэдрэлийн эсийн доройтол, мэдрэлийн хөгжлийн эмгэгүүдэд ажиглагддаг.
ASD нь нарийн төвөгтэй генетик болон эпигенетик архитектуртай олон янзын мэдрэлийн хөгжлийн эмгэг юм. ASD-ийн удамшлын шинж чанар нь маргаангүй боловч үндсэн молекулын шалтгаан нь сайн ойлгогдоогүй хэвээр байна. Эмнэлзүйн өмнөх загварууд, клиник судалгаа, олон омикс молекулын мэдээллийн сангаас хуримтлагдсан өгөгдөл нь ASD13,14-д митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал байгааг нотлох баримтыг улам бүр нэмэгдүүлж байна. Бид өмнө нь ASD-тэй өвчтөнүүдийн бүлэгт геномын хэмжээнд ДНХ-ийн метилжилтийн скрининг хийж, митохондрийн бодисын солилцооны замын дагуу бүлэглэсэн метилжсэн генүүдийг тодорхойлсон15. Дараа нь бид митохондрийн биогенез ба динамикийн төв зохицуулагчдын метилжилтийн ялгаатай байдлыг мэдээлсэн бөгөөд энэ нь ASD16-д mtДНХ-ийн хуулбарын тоо нэмэгдэж, шээсний бодисын солилцооны профайл өөрчлөгдсөнтэй холбоотой байв. Бидний өгөгдөл нь митохондрийн динамик ба гомеостаз нь ASD-ийн эмгэг жамд гол үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг нотлох баримтыг улам бүр нэмэгдүүлж байна. Тиймээс митохондрийн динамик, морфологи, үйл ажиллагааны хоорондын хамаарлын механик ойлголтыг сайжруулах нь хоёрдогч митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалаар тодорхойлогддог мэдрэлийн өвчний талаарх үргэлжилж буй судалгааны гол зорилго юм.
Митохондрийн стрессийн хариу урвалд тодорхой генийн үүргийг судлахын тулд молекулын техникийг ихэвчлэн ашигладаг. Гэсэн хэдий ч энэ арга нь митозын хяналтын механизмын олон талт, түр зуурын шинж чанараар хязгаарлагдаж болно. Түүнчлэн, митохондрийн генийн дифференциал илэрхийлэл нь үйл ажиллагааны өөрчлөлтийн шууд бус үзүүлэлт юм, ялангуяа зөвхөн хязгаарлагдмал тооны генийг ихэвчлэн шинжилдэг тул. Тиймээс митохондрийн үйл ажиллагаа болон биоэнергетикийг судлах илүү шууд аргуудыг санал болгосон17. Митохондрийн морфологи нь митохондрийн динамиктай нягт холбоотой. Митохондрийн хэлбэр, холболт, бүтэц нь энерги үйлдвэрлэх, митохондрийн болон эсийн амьдрах чадварт чухал үүрэг гүйцэтгэдэг5,18. Түүнээс гадна, митохондрийн морфологийн өөрчлөлтөд анхаарлаа хандуулдаг бөгөөд энэ нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд ашигтай төгсгөлийн цэг болж, дараагийн механик судалгааны үндэс суурь болж өгдөг.
Митохондрийн морфологийг дамжуулалтын электрон микроскоп (TEM) ашиглан шууд ажиглаж болох бөгөөд энэ нь эсийн хэт бүтцийг нарийвчлан судлах боломжийг олгодог. TEM нь зөвхөн генийн транскрипц, уургийн экспресс эсвэл эсийн популяци дахь митохондрийн функциональ параметрүүдэд найдахын оронд митохондрийн кристалын морфологи, хэлбэр, бүтцийг бие даасан митохондрийн шийдвэрээр шууд дүрсэлдэг17,19,20. Үүнээс гадна, TEM нь митохондрийн үйл ажиллагаа болон гомеостазд гол үүрэг гүйцэтгэдэг эндоплазмын торлог бүрхэвч ба аутофагосом зэрэг бусад эрхтэнүүдийн харилцан үйлчлэлийг судлахад тусалдаг21,22. Тиймээс энэ нь TEM-ийг тодорхой зам эсвэл генд анхаарлаа хандуулахаасаа өмнө митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалыг судлах сайн эхлэлийн цэг болгож байна. Митохондрийн үйл ажиллагаа нь мэдрэлийн эмгэг судлалд улам бүр хамааралтай болж байгаа тул митохондрийн морфологи болон динамикийг in vitro мэдрэлийн загварт шууд болон тоон байдлаар судлах боломжтой байх шаардлагатай болж байна.
Энэ нийтлэлд бид аутизмын спектрийн эмгэгийн үед митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалын мэдрэлийн эсийн загварт митохондрийн динамикийг судална. Бид өмнө нь митохондрийн пропионил-КоА карбоксилаза ферментийн PCC-ийн дэд нэгж болох ASD15-д пропионил-КоА карбоксилаза бета (PCCB)-ийн метилжилтийн дифференциал байдлыг мэдээлсэн. PCC-ийн зохицуулалтын алдагдал нь пропионил деривативууд, түүний дотор пропионы хүчил (PPA)23,24,25-ийн хортой хуримтлалыг үүсгэдэг нь мэдэгдэж байна. PPA нь мэдрэлийн эсийн бодисын солилцоог алдагдуулж, зан үйлийг in vivo өөрчилдөг нь батлагдсан бөгөөд ASD26,27,28-д оролцдог мэдрэлийн хөгжлийн механизмыг судлах тогтсон амьтны загвар юм. Нэмж дурдахад, PPA нь in vitro митохондрийн мембраны потенциал, биогенез болон амьсгалыг алдагдуулдаг гэж мэдээлсэн бөгөөд мэдрэлийн эсүүдэд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалыг загварчлахад өргөн хэрэглэгддэг29,30. Гэсэн хэдий ч PPA-аар өдөөгдсөн митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал нь митохондрийн морфологи болон динамикт үзүүлэх нөлөөг сайн ойлгоогүй хэвээр байна.
Энэхүү судалгаа нь SH-SY5Y эсүүдэд PPA-ийн митохондрийн морфологи, динамик болон үйл ажиллагаанд үзүүлэх нөлөөллийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлоход нэмэлт дүрслэлийн техникийг ашигладаг. Нэгдүгээрт, бид митохондрийн морфологи болон хэт бүтцийн өөрчлөлтийг дүрслэн харуулах TEM аргыг боловсруулсан17,31,32. Митохондрийн динамик шинж чанарыг харгалзан үзвэл33 бид мөн PPA стрессийн дор хуваагдал ба нэгдлийн үйл явдлуудын тэнцвэр, митохондрийн тоо, эзэлхүүний өөрчлөлтийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлохын тулд митохондрийн үйл явдлын байршлын шинжилгээг ашигласан. Эцэст нь бид митохондрийн морфологи ба динамик нь биогенез, хуваагдал ба нэгдэлд оролцдог генийн илэрхийлэлийн өөрчлөлттэй холбоотой эсэхийг судалсан. Нийтдээ бидний өгөгдөл нь митохондрийн динамикийг зохицуулдаг механизмын нарийн төвөгтэй байдлыг тодруулах сорилтыг харуулж байна. Бид SH-SY5Y эсүүдэд митохондрийн морфологийг хэмжих боломжтой конвергент төгсгөлийн цэг болгон судлахад TEM-ийн ашиг тусыг онцолсон. Нэмж дурдахад, бид TEM өгөгдөл нь бодисын солилцооны стрессийн хариуд динамик үйл явдлуудыг харуулдаг дүрслэлийн техниктэй хослуулан хамгийн баялаг мэдээллийг өгдөг гэдгийг онцолсон. Мэдрэлийн эсийн митозыг дэмждэг молекулын зохицуулалтын механизмын цаашдын шинж чанарыг судлах нь мэдрэлийн систем болон мэдрэлийн эсийн дегенератив өвчний митохондрийн бүрэлдэхүүн хэсгийн талаар чухал ойлголт өгөх боломжтой.
Митохондрийн стрессийг өдөөхийн тулд SH-SY5Y эсүүдийг 3 мМ ба 5 мМ натрийн пропионат (NaP) ашиглан PPA-аар боловсруулсан. TEM-ээс өмнө дээжийг өндөр даралттай хөлдөөх болон хөлдөөх аргаар криогенийн дээж бэлтгэхэд оруулсан (Зураг 1a). Бид гурван биологийн давталтаар митохондрийн популяцийн найман морфологийн параметрийг хэмжих автомат митохондрийн дүрсний шинжилгээний хоолойг боловсруулсан. PPA эмчилгээ нь дөрвөн параметрийг мэдэгдэхүйц өөрчилсөн болохыг бид тогтоосон: 2-р талбай, талбай, периметр, Феретийн диаметр (Зураг 1b–e). 2-р талбай нь 3 мМ ба 5 мМ PPA эмчилгээнд мэдэгдэхүйц буурсан (p = 0.0183 ба p = 0.002 тус тус) (Зураг 1b), харин талбай (p = 0.003), периметр (p = 0.0106) болон Феретийн диаметр бүгд мэдэгдэхүйц буурсан. Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад 5 мМ эмчилгээний бүлэгт мэдэгдэхүйц бууралт (p = 0.0172) ажиглагдсан (Зураг 1c–e). Талбай болон тойргийн мэдэгдэхүйц бууралт нь 5 мМ PPA-аар эмчилсэн эсүүд нь жижиг, илүү бөөрөнхий митохондритай байсан бөгөөд эдгээр митохондри нь хяналтын эсүүдээс бага сунасан болохыг харуулсан. Энэ нь мөн Феретийн диаметр мэдэгдэхүйц буурсантай нийцэж байгаа бөгөөд энэ нь бөөмийн ирмэгүүдийн хоорондох хамгийн том зай буурч байгааг илтгэдэг бие даасан параметр юм. Кристагийн хэт бүтцийн өөрчлөлт ажиглагдсан: PPA стрессийн нөлөөгөөр кристал нь бага тод болсон (Зураг 1a, B самбар). Гэсэн хэдий ч бүх зураг кристалын хэт бүтцийг тодорхой тусгаагүй тул эдгээр өөрчлөлтийн тоон шинжилгээг хийгээгүй болно. Эдгээр TEM өгөгдөл нь гурван боломжит хувилбарыг тусгаж болно: (1) PPA нь хуваагдлыг сайжруулдаг эсвэл нэгдлийг дарангуйлдаг бөгөөд одоо байгаа митохондрийн хэмжээг багасгахад хүргэдэг; (2) биогенезийг сайжруулсан нь шинэ, жижиг митохондри үүсгэдэг эсвэл (3) хоёр механизмыг нэгэн зэрэг өдөөдөг. Эдгээр нөхцлийг TEM-ээр ялгаж чадахгүй ч морфологийн мэдэгдэхүйц өөрчлөлтүүд нь митохондрийн гомеостаз болон PPA стрессийн дор динамикийн өөрчлөлтийг илтгэнэ. Дараа нь бид эдгээр динамик болон тэдгээрийн цаана байгаа боломжит механизмуудыг цаашид тодорхойлохын тулд нэмэлт параметрүүдийг судалсан.
Пропионы хүчил (PPA) нь митохондрийн морфологийг дахин бүтээдэг. (a) PPA эмчилгээ нэмэгдэхийн хэрээр митохондрийн хэмжээ багасч, митохондри жижиг болж, бөөрөнхий болж байгааг харуулсан төлөөллийн дамжуулалтын электрон микроскоп (TEM) зургууд; тус тус 0 мМ (эмчилгээгүй), 3 мМ ба 5 мМ. Улаан сумнууд нь митохондриаг заана. (b–e) 24 цагийн турш PPA-аар эмчилсэн SH-SY5Y эсүүдийг TEM-д бэлтгэж, үр дүнг Fiji/ImageJ ашиглан шинжилсэн. Найман параметрийн дөрөв нь хяналтын (эмчилгээгүй, 0 мМ PPA) болон эмчилсэн (3 мМ ба 5 мМ PPA) эсүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгааг харуулсан. (b) 2-р бүс, (c) Талбай, (d) Периметр, (e) Феретийн диаметр. Нэг талын дисперсийн шинжилгээ (хяналт ба эмчилгээ) болон Даннеттын олон харьцуулалтын тестийг ашиглан мэдэгдэхүйц ялгааг тодорхойлсон (p < 0.05). Өгөгдлийн цэгүүд нь эс бүрийн дундаж митохондрийн утгыг, алдааны баарууд нь дундаж ± SEM-ийг илэрхийлнэ. Харуулсан өгөгдөл нь n = 3, нэг давталт тутамд дор хаяж 24 нүдийг илэрхийлж байна; нийт 266 зургийг шинжилсэн; * нь p < 0.05, ** нь p < 0.01-ийг илэрхийлнэ.
Митохондрийн динамик нь PPA-д хэрхэн хариу үйлдэл үзүүлдэгийг цаашид тодорхойлохын тулд бид митохондриаг тетраметилродамин этилийн эфир (TMRE)-ээр будаж, 3 ба 5 мМ PPA-д 24 цагийн дараа митохондриаг байршлыг нь тодорхойлж, тоон үзүүлэлтийг тодорхойлохын тулд цагийн дамжуулалтын микроскоп болон MEL шинжилгээг ашигласан. Хуваагдал ба нэгдлийн үйл явдлын эмчилгээ. (Зураг 2a). MEL шинжилгээний дараа митохондриаг митохондрийн бүтцийн тоо болон тэдгээрийн дундаж эзэлхүүнийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлохын тулд цаашид шинжилсэн. Бид 3 мМ [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] үед тохиолдох хуваагдлын үйл явдлын тоо бага боловч мэдэгдэхүйц өссөнийг ажигласан бөгөөд хуваагдал [5.6 ± 0.3 (p < 0.05))] болон нэгдэл [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] болон нэгдэл [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] үйл явдлууд хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад 5 мМ-д мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 3b). Митохондрийн тоо 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] болон 5 мМ [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] хоёуланд нь мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 3c), харин митохондрийн бүтэц бүрийн дундаж эзэлхүүн өөрчлөгдөөгүй хэвээр байна (Зураг 3c). 3d). Энэ нь митохондрийн динамикийг дахин загварчлах нь митохондрийн сүлжээний бүрэн бүтэн байдлыг амжилттай хадгалдаг нөхөн төлбөрийн хариу үйлдэл болж байгааг харуулж байна. 3 мМ PPA-д хуваагдлын үйл явдлын тоо нэмэгдсэн нь митохондрийн тооны өсөлт нь митохондрийн хуваагдлаас үүдэлтэй болохыг харуулж байгаа боловч митохондрийн дундаж эзэлхүүн үндсэндээ өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгааг харгалзан биогенезийг нэмэлт нөхөн төлбөрийн хариу урвал гэж үгүйсгэх боломжгүй юм. Гэсэн хэдий ч эдгээр өгөгдөл нь TEM-ээр ажиглагдсан жижиг, дугуй митохондрийн бүтэцтэй нийцэж байгаа бөгөөд мөн PPA-аар өдөөгдсөн митохондрийн динамикт мэдэгдэхүйц өөрчлөлтүүдийг харуулж байна.
Пропионы хүчил (PPA) нь сүлжээний бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахын тулд митохондрийн динамик өөрчлөлтийг өдөөдөг. SH-SY5Y эсүүдийг өсгөвөрлөж, 24 цагийн турш 3 ба 5 мМ PPA-аар боловсруулж, TMRE болон Hoechst 33342-оор будсан бөгөөд дараа нь MEL шинжилгээ хийсэн. (a) Нөхцөл байдал бүрийн 2-р үед (t2) өнгө болон хоёртын хамгийн их эрчимтэй төсөөллийг харуулсан цагийн давтамжийн микроскопийн дүрс. Хоёртын зураг бүрт заасан сонгосон бүсүүдийг сайжруулж, цаг хугацааны явцад динамикийг харуулахын тулд гурван өөр хугацааны хүрээнд (t1-t3) 3D хэлбэрээр харуулсан; нэгдлийн үйл явдлыг ногооноор тодруулсан; хуваагдлын үйл явдлыг ногооноор тодруулсан. Улаанаар харуулсан. (b) Нөхцөл байдал тус бүрийн динамик үйл явдлын дундаж тоо. (c) Эс тус бүрийн митохондрийн бүтцийн дундаж тоо. (d) Эс тус бүрийн митохондрийн бүтэц бүрийн дундаж эзэлхүүн (µm3). Харуулсан өгөгдөл нь эмчилгээний бүлэг тус бүрийн n = 15 эсийг төлөөлж байна. Харуулсан алдааны баарууд нь дундаж ± SEM, масштабын баар = 10 μm, * p < 0.05-ийг илэрхийлнэ.
Пропионы хүчил (PPA) нь митохондрийн динамиктай холбоотой генүүдийн транскрипцийн дарангуйллыг үүсгэдэг. SH-SY5Y эсүүдийг 24 цагийн турш 3 ба 5 мМ PPA-аар эмчилсэн. Харьцангуй генийн тоон үзүүлэлтийг RT-qPCR ашиглан хийж, B2M болгон хэвийн болгосон. Митохондрийн биогенезийн генүүд (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 ба (d) NFE2L2. Митохондрийн нэгдэл ба хуваагдлын генүүд (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 ба (i) DRP1. Мэдэгдэхүйц ялгааг (p < 0.05) нэг талын ANOVA (хяналт ба эмчилгээ) болон Даннеттын олон харьцуулалтын тест ашиглан туршсан: * нь p < 0.05, ** нь p < 0.01, **** нь p < 0.0001 байгааг харуулж байна. Баарнууд нь дундаж илэрхийлэл ± SEM-ийг илэрхийлнэ. Харуулсан өгөгдөл нь n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), болон n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологийн давталтуудыг илэрхийлнэ.
TEM болон MEL шинжилгээний өгөгдлүүд хамтдаа PPA нь митохондрийн морфологи болон динамикийг өөрчилдөг болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч эдгээр дүрслэх аргууд нь эдгээр үйл явцыг хөдөлгөж буй үндсэн механизмын талаар ойлголт өгөхгүй байна. Тиймээс бид PPA эмчилгээнд хариу үйлдэл үзүүлэхдээ митохондрийн динамик, биогенез, митозын есөн гол зохицуулагчийн mRNA экспрессийг судалсан. Бид эсийн миелома онкоген (cMYC), цөмийн амьсгалын замын хүчин зүйл (NRF1), митохондрийн транскрипцийн хүчин зүйл 1 (TFAM), NFE2 төст транскрипцийн хүчин зүйл BZIP (NFE2L2), гастрин төст уураг 2 (STOML2), харааны мэдрэлийн хатингаршил 1 (OPA1), Митофусин 1 (MFN1), Митофусин 2 (MFN2) болон динаминтай холбоотой уураг 1 (DRP1)-ийг 3 мМ ба 5 мМ PPA-аар 24 цагийн турш эмчилсний дараа тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Бид 3 мМ (p = 0.0053, p = 0.0415 ба p < 0.0001 тус тус) ба 5 мМ (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) PPA эмчилгээг ажигласан. (Зураг 3a–c). mRNA-ийн экспрессийн бууралт нь тунгаас хамааралтай байсан: cMYC, NRF1 ба TFAM-ийн экспресс нь 3 мМ-д тус тус 5.7, 2.6 ба 1.9 дахин, 5 мМ-д 11.2, 3 ба 2.2 дахин буурсан. Үүний эсрэгээр төвийн редокс биогенезийн ген NFE2L2 нь PPA-ийн ямар ч концентрацид өөрчлөгдөөгүй боловч экспрессийн бууралтын тунгаас хамааралтай ижил төстэй хандлага ажиглагдсан (Зураг 3d).
Бид мөн хуваагдал ба нэгдлийг зохицуулахад оролцдог сонгодог генүүдийн экспрессийг судалсан. STOML2 нь нэгдэл, митофаги ба биогенезид оролцдог гэж үздэг бөгөөд түүний экспресс нь 3 мМ (2.4 дахин өөрчлөлт) болон 5 мМ (2.8 дахин өөрчлөлт) PPA-аар мэдэгдэхүйц буурсан (p < 0.0001) (Зураг 1). 3d). Үүнтэй адилаар OPA1 нэгдэл генийн экспресс нь 3 мМ (1.6 дахин өөрчлөлт) болон 5 мМ (1.9 дахин өөрчлөлт) PPA (p = 0.006 ба p = 0.0024 тус тус)-д буурсан (Зураг 3f). Гэсэн хэдий ч бид 24 цагийн PPA стрессийн дор нэгдэл генүүд болох MFN1, MFN2 эсвэл хуваагдлын ген DRP1-ийн экспрессэд мэдэгдэхүйц ялгаа олоогүй (Зураг 3g–i). Үүнээс гадна, бид дөрвөн нэгдэл ба хуваагдлын уургийн (OPA1, MFN1, MFN2 болон DRP1) түвшин ижил нөхцөлд өөрчлөгдөөгүй болохыг тогтоосон (Зураг 4a–d). Эдгээр өгөгдөл нь цаг хугацааны ганц цэгийг тусгасан бөгөөд PPA стрессийн эхний үе шатанд уургийн илэрхийлэл эсвэл идэвхжилийн түвшний өөрчлөлтийг тусгаагүй байж болохыг тэмдэглэх нь чухал юм. Гэсэн хэдий ч cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 болон OPA1-ийн илэрхийлэл мэдэгдэхүйц буурсан нь митохондрийн метаболизм, биогенез, динамикийн транскрипцийн мэдэгдэхүйц алдагдал байгааг харуулж байна. Үүнээс гадна эдгээр өгөгдөл нь митохондрийн үйл ажиллагааны төгсгөлийн төлөвийн өөрчлөлтийг шууд судлах дүрслэх аргын ашиг тусыг онцолж байна.
Пропионы хүчил (PPA)-ийн эмчилгээний дараа нэгдэл ба хуваагдлын хүчин зүйлийн уургийн түвшин өөрчлөгдөөгүй. SH-SY5Y эсүүдийг 24 цагийн турш 3 ба 5 мМ PPA-аар эмчилсэн. Уургийн түвшинг Вестерн блот шинжилгээгээр тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж, экспрессийн түвшинг нийт уураг болгон хэвийн болгосон. Уургийн дундаж экспресс болон зорилтот болон нийт уургийн төлөөллийн Вестерн блотыг харуулав. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Баарнууд нь дундаж ± SEM-ийг илэрхийлдэг бөгөөд харуулсан өгөгдөл нь n = 3 биологийн давталтыг төлөөлдөг. Олон харьцуулалтыг (p < 0.05) нэг талын дисперсийн шинжилгээ болон Даннеттын тест ашиглан гүйцэтгэсэн. Анхны гель болон блотыг S1 зурагт үзүүлэв.
Митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал нь бодисын солилцоо, зүрх судасны болон булчингийн өвчнөөс эхлээд мэдрэлийн өвчин хүртэлх олон системийн өвчинтэй холбоотой байдаг1,10. Мэдрэлийн эсийн доройтол ба мэдрэлийн эсийн доройтлын олон өвчин нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай холбоотой байдаг бөгөөд энэ нь тархины амьдралын туршид эдгээр эрхтэнүүдийн ач холбогдлыг онцолж өгдөг. Эдгээр өвчинд Паркинсоны өвчин, Альцгеймерийн өвчин болон ASD3,4,18 орно. Гэсэн хэдий ч эдгээр өвчнийг судлахын тулд тархины эдэд хандах нь ялангуяа механик түвшинд хэцүү байдаг тул эсийн загвар системийг зайлшгүй хувилбар болгож байна. Энэхүү судалгаанд бид мэдрэлийн өвчин, ялангуяа аутизмын спектрийн эмгэгүүдэд ажиглагдсан митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдлыг давтахын тулд PPA-ээр эмчилсэн SH-SY5Y эсийг ашиглан эсийн загвар системийг ашигладаг. Мэдрэлийн эсүүд дэх митохондрийн динамикийг судлахын тулд энэхүү PPA загварыг ашиглах нь ASD-ийн шалтгааныг ойлгоход тусална.
Бид митохондрийн морфологийн өөрчлөлтийг харахын тулд TEM ашиглах боломжийг судалсан. Үр нөлөөг нь нэмэгдүүлэхийн тулд TEM-ийг зөв ашиглах ёстой гэдгийг тэмдэглэх нь чухал юм. Крио-дээж бэлтгэх нь эсийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг нэгэн зэрэг бэхжүүлж, артефакт үүсэхийг бууруулснаар мэдрэлийн эсийн бүтцийг илүү сайн хадгалах боломжийг олгодог34. Үүнтэй уялдуулан бид мэдрэлийн эстэй төстэй SH-SY5Y эсүүд нь бүрэн бүтэн эсийн доорх органелл болон сунасан митохондритай болохыг ажигласан (Зураг 1a). Энэ нь мэдрэлийн эсийн загварт митохондрийн морфологийг судлахад криоген бэлтгэлийн техникүүдийн ашиг тусыг онцолж байна. TEM өгөгдлийг объектив дүн шинжилгээ хийхэд тоон хэмжилт чухал боловч митохондрийн морфологийн өөрчлөлтийг баталгаажуулахын тулд ямар тодорхой параметрүүдийг хэмжих ёстой талаар нэгдсэн ойлголт байхгүй хэвээр байна. Митохондрийн морфологийг тоон үзүүлэлтээр судалсан олон тооны судалгаан дээр үндэслэн17,31,32 бид найман морфологийн параметрийг хэмждэг автомат митохондрийн дүрсний шинжилгээний хоолойг боловсруулсан: талбай, талбай2, харьцаа, периметр, тойрог, зэрэг, Феретийн диаметр. болон бөөрөнхий байдал.
Тэдгээрийн дотор PPA нь 2-р талбай, талбай, периметр, Феретийн диаметрийг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Зураг 1b–e). Энэ нь митохондри жижиг, бөөрөнхий болсон болохыг харуулсан бөгөөд энэ нь PPA30-ээр өдөөгдсөн митохондрийн стрессийн 72 цагийн дараа митохондрийн талбай буурсан өмнөх судалгаануудтай нийцэж байна. Эдгээр морфологийн шинж чанарууд нь митохондрийн хуваагдлыг илтгэж болох бөгөөд энэ нь митохондрийн сүлжээнээс гэмтсэн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгаж, митофаги35,36,37-аар дамжуулан задралыг дэмжихэд шаардлагатай үйл явц юм. Нөгөөтэйгүүр, митохондрийн дундаж хэмжээ буурах нь биогенезийн өсөлттэй холбоотой байж болох бөгөөд энэ нь жижиг шинээр гарч ирж буй митохондри үүсэхэд хүргэдэг. Хуваагдал буюу биогенезийн өсөлт нь митохондрийн стрессийн эсрэг митозыг хадгалах нөхөн төлбөрийн хариу урвалыг илэрхийлдэг. Гэсэн хэдий ч митохондрийн өсөлт буурах, нэгдэх үйл явцын сулрал эсвэл бусад нөхцөл байдлыг үгүйсгэх боломжгүй юм.
TEM-ээр үүсгэсэн өндөр нягтралтай зургууд нь бие даасан митохондрийн түвшинд морфологийн шинж чанарыг тодорхойлох боломжийг олгодог боловч энэ арга нь цаг хугацааны нэг цэг дээр хоёр хэмжээст агшин зургийг гаргадаг. Бодисын солилцооны стрессийн динамик хариу урвалыг судлахын тулд бид митохондриаг TMRE-ээр будаж, MEL шинжилгээтэй цагийн урсгалын микроскоп ашигласан бөгөөд энэ нь митохондрийн сүлжээнд цаг хугацааны явцад гарсан өөрчлөлтийг өндөр хүчин чадалтай 3 хэмжээст дүрслэх боломжийг олгодог33,38. Бид PPA стрессийн дор митохондрийн динамикт нарийн боловч мэдэгдэхүйц өөрчлөлтүүдийг ажигласан (Зураг 2). 3 мМ-д хуваагдлын үйл явдлын тоо мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн бол нэгдэх үйл явдал хяналтын бүлэгтэй ижил хэвээр байв. 5 мМ PPA-д хуваагдлын болон нэгдэх үйл явдлын тоо нэмэгдсэн нь ажиглагдсан боловч эдгээр өөрчлөлтүүд ойролцоогоор пропорциональ байсан нь хуваагдлын болон нэгдэх кинетик нь өндөр концентрацид тэнцвэрт байдалд хүрдэг болохыг харуулж байна (Зураг 2б). Митохондрийн дундаж хэмжээ 3 ба 5 мМ PPA-д өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгаа нь митохондрийн сүлжээний бүрэн бүтэн байдал хадгалагдсаныг харуулж байна (Зураг 2d). Энэ нь динамик митохондрийн сүлжээнүүд нь сүлжээний хуваагдал үүсгэхгүйгээр гомеостазыг үр дүнтэй хадгалахын тулд бага зэргийн бодисын солилцооны стресст хариу үйлдэл үзүүлэх чадварыг тусгадаг. 3 мМ PPA-д хуваагдлын өсөлт нь шинэ тэнцвэрт байдалд шилжихэд хангалттай боловч PPA-ийн өндөр концентрациас үүдэлтэй стрессийн хариуд илүү гүнзгий кинетик өөрчлөлт шаардлагатай байдаг.
PPA стрессийн хоёр концентрацид митохондрийн тоо нэмэгдсэн боловч митохондрийн дундаж эзэлхүүн мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй (Зураг 2c). Энэ нь биогенез нэмэгдсэн эсвэл хуваагдал нэмэгдсэнтэй холбоотой байж болох юм; гэсэн хэдий ч митохондрийн дундаж эзэлхүүн мэдэгдэхүйц буураагүй тохиолдолд биосинтез нэмэгдэх магадлал өндөр байдаг. Гэсэн хэдий ч Зураг 2-т үзүүлсэн өгөгдөл нь хоёр нөхөн төлбөрийн механизм байгааг баталж байна: митохондрийн хуваагдлын зохицуулалт нэмэгдсэнтэй нийцсэн хуваагдлын үйл явдлын тоо нэмэгдэх, митохондрийн биогенезтэй нийцсэн үйл явдлын тоо нэмэгдэх. Эцсийн эцэст бага зэргийн стрессийн динамик нөхөн төлбөр нь хуваагдал, нэгдэл, биогенез, митофаги зэрэг нэгэн зэрэг явагдах үйл явцаас бүрдэж болно. Өмнөх зохиогчид PPA нь митозыг30,39 болон митофаги29 нэмэгдүүлдэг болохыг харуулсан боловч бид PPA-д хариу үйлдэл үзүүлэх митохондрийн хуваагдал болон нэгдлийн динамикийг дахин загварчлах нотолгоог өгч байна. Эдгээр өгөгдөл нь TEM-ээр ажиглагдсан морфологийн өөрчлөлтийг баталгаажуулж, PPA-аар өдөөгдсөн митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай холбоотой механизмын талаар илүү гүнзгий ойлголт өгөх болно.
TEM болон MEL шинжилгээ нь ажиглагдсан морфологийн өөрчлөлтийн үндэс суурь болсон генийн зохицуулалтын механизмын шууд нотолгоо өгөөгүй тул бид митохондрийн солилцоо, биогенез, динамикт оролцдог генүүдийн РНХ-ийн экспрессийг судалсан. cMYC протоонкоген нь митохондри, гликолиз, амин хүчил, өөх тосны хүчлийн солилцооны зохицуулалтад оролцдог транскрипцийн хүчин зүйл юм40. Үүнээс гадна, cMYC нь NRF1 болон TFAM41 зэрэг митохондрийн транскрипц, орчуулга, цогцолбор угсралтад оролцдог бараг 600 митохондрийн генийн экспрессийг зохицуулдаг гэдгээрээ алдартай. NRF1 болон TFAM нь митохондрийн транскрипц, орчуулга, цогцолбор угсралтад оролцдог бараг 600 митохондрийн генийн экспрессийг зохицуулдаг. NRF1 болон TFAM нь митозын хоёр төв зохицуулагч бөгөөд PGC-1α-ийн доор mtDNA репликацийг идэвхжүүлдэг. Энэ зам нь cAMP болон AMPK дохиололоор идэвхждэг бөгөөд энергийн зарцуулалт болон бодисын солилцооны стрессд мэдрэмтгий байдаг. Мөн бид PPA-ийн нөлөө нь исэлдэлтийн стрессээр зуучлагдах эсэхийг тодорхойлохын тулд митохондрийн биогенезийн исэлдэлтийн зохицуулагч NFE2L2-ийг судалсан.
Хэдийгээр NFE2L2 илэрхийлэл өөрчлөгдөөгүй хэвээр байсан ч 3 мМ ба 5 мМ PPA-тай 24 цагийн эмчилгээ хийсний дараа cMYC, NRF1 болон TFAM-ийн илэрхийлэл тунгаас хамааралтай тогтвортой буурч байгааг бид олж мэдсэн (Зураг 3a–c). cMYC илэрхийлэлийн бууралт нь өмнө нь митохондрийн стрессийн хариу урвал гэж мэдээлсэн42 бөгөөд эсрэгээрээ cMYC илэрхийлэлийн бууралт нь митохондрийн метаболизм, сүлжээний холболт, мембраны туйлшралыг дахин загварчлах замаар митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд хүргэж болзошгүй43. Сонирхолтой нь, cMYC нь митохондрийн хуваагдал ба нэгдлийн зохицуулалтад оролцдог42,43 бөгөөд эсийн хуваагдлын үед DRP1 фосфоржуулалт болон митохондрийн байршлыг нэмэгдүүлдэг44, мөн мэдрэлийн үүдэл эсүүдэд митохондрийн морфологийн шинэчлэлийг зуучилдаг45 гэдгээрээ алдартай. Үнэндээ cMYC дутагдалтай фибробластууд нь PPA43 стрессээс үүдэлтэй өөрчлөлтүүдтэй нийцүүлэн митохондрийн хэмжээг бууруулдаг. Эдгээр өгөгдөл нь cMYC болон митохондрийн динамикийн хоорондын сонирхолтой боловч хараахан тодорхойгүй хамаарлыг харуулж байгаа бөгөөд PPA стрессээс үүдэлтэй өөрчлөлтийн ирээдүйн судалгаанд сонирхолтой зорилт тавьж байна.
NRF1 болон TFAM-ийн бууралт нь cMYC-ийн чухал транскрипцийн идэвхжүүлэгчийн үүрэгтэй нийцэж байна. Эдгээр өгөгдөл нь хүний ​​бүдүүн гэдэсний хорт хавдрын эсүүд дээр хийсэн өмнөх судалгаануудтай нийцэж байгаа бөгөөд PPA нь 22 цагийн дотор NRF1 mRNA экспрессийг бууруулсан нь ATP-ийн хомсдол болон ROS46-ийн өсөлттэй холбоотой болохыг харуулсан. Эдгээр зохиогчид мөн TFAM экспресс 8.5 цагийн дараа нэмэгдсэн боловч 22 цагийн дараа суурь түвшиндээ эргэн орсон гэж мэдээлсэн. Үүний эсрэгээр, Ким нар (2019) SH-SY5Y эсүүдэд PPA стрессийн 4 цагийн дараа TFAM mRNA экспресс мэдэгдэхүйц буурсан болохыг харуулсан; гэсэн хэдий ч 72 цагийн дараа TFAM уургийн экспресс мэдэгдэхүйц нэмэгдэж, mtDNA хуулбарын тоо мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн. Тиймээс бидний 24 цагийн дараа ажигласан митохондрийн биогенезийн генийн тоо буурсан нь митохондрийн тоо нэмэгдэх нь эрт үеийн цэгүүдэд биогенезийн идэвхжилтэй холбоотой байх магадлалыг үгүйсгэхгүй. Өмнөх судалгаагаар PPA нь SH-SY5Y эсүүдэд PGC-1α мРНХ болон уургийг 4 цаг 30 минутад мэдэгдэхүйц нэмэгдүүлдэг бол пропионы хүчил нь 12 цаг 39 минутад PGC-1α-аар дамжуулан тугалын гепатоцитуудад митохондрийн биогенезийг сайжруулдаг болохыг харуулсан. Сонирхолтой нь, PGC-1α нь зөвхөн NRF1 болон TFAM-ийн шууд транскрипцийн зохицуулагч төдийгүй хуваагдал ба нэгдлийг зохицуулснаар MFN2 болон DRP1-ийн идэвхжилийг зохицуулдаг болох нь батлагдсан47. Энэ нь PPA-ийн өдөөгдсөн митохондрийн нөхөн төлбөрийн хариу урвалыг зохицуулдаг механизмуудын нягт холбоог онцолж байна. Түүнээс гадна, бидний өгөгдөл нь PPA стрессийн дор биогенез ба бодисын солилцооны транскрипцийн зохицуулалтын мэдэгдэхүйц алдагдлыг харуулж байна.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 болон DRP1 генүүд нь митохондрийн хуваагдал, нэгдэл болон динамикийн төв зохицуулагчдын нэг юм37,48,49. Митохондрийн динамикт оролцдог бусад олон генүүд байдаг боловч STOML2, OPA1 болон MFN2 нь өмнө нь ASD когортуудад ялгаварлан метилжсэн болохыг тогтоосон бөгөөд хэд хэдэн бие даасан судалгаагаар митохондрийн стрессийн хариуд эдгээр транскрипцийн хүчин зүйлсийн өөрчлөлтийг мэдээлсэн50,51.52. OPA1 болон STOML2-ийн илэрхийлэл нь 3 мМ ба 5 мМ PPA эмчилгээ хийснээр мэдэгдэхүйц буурсан (Зураг 3e, f). OPA1 нь MFN1 ба 2-той шууд харилцан үйлчлэлцэх замаар митохондрийн нэгдлийн сонгодог зохицуулагчдын нэг бөгөөд кристийн өөрчлөлт болон митохондрийн морфологид чухал үүрэг гүйцэтгэдэг53. STOML2-ийн митохондрийн динамикт яг ямар үүрэг гүйцэтгэдэг нь тодорхойгүй хэвээр байгаа ч нотолгоо нь энэ нь митохондрийн нэгдэл, биогенез болон митофагид чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
STOML2 нь митохондрийн амьсгалын замын холбоог хадгалах, амьсгалын гинжин хэлхээний цогцолбор үүсгэхэд оролцдог54,55 бөгөөд хорт хавдрын эсийн бодисын солилцооны шинж чанарыг гүнзгий өөрчилдөг болох нь батлагдсан56. Судалгаагаар STOML2 нь BAN болон кардиолипинтэй харилцан үйлчлэлцэх замаар митохондрийн мембраны потенциал болон биогенезийг дэмждэг болохыг харуулсан55, 57, 58. Нэмж дурдахад, бие даасан судалгаагаар STOML2 болон PINK1-ийн харилцан үйлчлэл нь митофагийг зохицуулдаг59,60 болохыг харуулсан. STOML2 нь MFN2-тэй шууд харилцан үйлчилж, тогтворжуулдаг бөгөөд OPA1-ийн задралыг хариуцдаг протеазыг дарангуйлснаар OPA1-ийн урт изоформуудыг тогтворжуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг53,61,62. PPA урвалд ажиглагдсан STOML2-ийн экспрессийн бууралт нь эдгээр нэгдлийн уургуудыг убиквитин ба протеасомоос хамааралтай замаар задралд илүү өртөмтгий болгож болзошгүй48. PPA-д үзүүлэх динамик хариу урвалд STOML2 болон OPA1-ийн яг ямар үүрэг гүйцэтгэдэг нь тодорхойгүй байгаа ч эдгээр нэгдлийн генийн экспресс буурах нь (Зураг 3) хуваагдал ба нэгдлийн тэнцвэрийг алдагдуулж, митохондрийн хэмжээ буурахад хүргэж болзошгүй (Зураг 3). 1).
Нөгөөтэйгүүр, OPA1 уургийн илэрхийлэл 24 цагийн дараа өөрчлөгдөөгүй хэвээр байсан бол MFN1, MFN2 эсвэл DRP1-ийн mRNA болон уургийн түвшин PPA эмчилгээний дараа мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй (Зураг 3g-i, Зураг 4). Энэ нь митохондрийн нэгдэл ба хуваагдалд оролцдог эдгээр хүчин зүйлсийн зохицуулалтад ямар ч өөрчлөлт ороогүй болохыг харуулж байж магадгүй юм. Гэсэн хэдий ч эдгээр дөрвөн ген тус бүр нь уургийн идэвхжилийг хянадаг транскрипцийн дараах өөрчлөлтүүд (PTM)-ээр зохицуулагддаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. OPA1 нь митохондрид уураг задлах замаар хуваагддаг найман өөр хувилбартай бөгөөд хоёр өөр изоформ үүсгэдэг 63. Урт ба богино изоформуудын хоорондох тэнцвэр нь эцсийн дүндээ OPA1-ийн митохондрийн нэгдэл ба митохондрийн сүлжээг хадгалах үүргийг тодорхойлдог64. DRP1-ийн идэвхжил нь кальци/калмодулинаас хамааралтай уургийн киназа II (CaMKII) фосфоржуулалтаар зохицуулагддаг бол DRP1-ийн задрал нь убиквитинжуулалт ба SUMOylation-ээр зохицуулагддаг65. Эцэст нь, DRP1 болон MFN1/2 хоёулаа GTPаза тул идэвхжил нь митохондрид GTP үйлдвэрлэлийн хурдаас хамаарч болно 66. Тиймээс эдгээр уургийн илэрхийлэл тогтмол хэвээр байгаа ч энэ нь өөрчлөгдөөгүй уургийн идэвхжил эсвэл байршлыг тусгахгүй байж магадгүй юм67,68. Үнэндээ одоо байгаа PTM уургийн репертуар нь цочмог стрессийн хариу урвалыг зуучлах үүрэгтэй хамгаалалтын эхний шугам болж үйлчилдэг. Бидний загварт дунд зэргийн бодисын солилцооны стресс байгаа тохиолдолд PTM нь mRNA эсвэл уургийн түвшинд эдгээр генийг нэмэлт идэвхжүүлэх шаардлагагүйгээр митохондрийн бүрэн бүтэн байдлыг хангалттай сэргээхийн тулд нэгдэл ба хуваагдлын уургийн идэвхжилийг нэмэгдүүлэх магадлалтай.
Дээрх өгөгдлүүдийг нэгтгэн дүгнэвэл митохондрийн морфологийн нарийн төвөгтэй, цаг хугацаанаас хамааралтай зохицуулалт болон эдгээр механизмыг тодруулахад тулгарч буй бэрхшээлүүдийг онцолж байна. Генийн экспрессийг судлахын тулд эхлээд замд байгаа тодорхой зорилтот генийг тодорхойлох шаардлагатай. Гэсэн хэдий ч бидний өгөгдлүүдээс харахад нэг замд байгаа генүүд ижил стрессд ижил хариу үйлдэл үзүүлдэггүй. Үнэндээ өмнөх судалгаанууд нэг замд байгаа өөр өөр генүүд өөр өөр түр зуурын хариу урвалын профайлыг харуулж болохыг харуулсан30,46. Үүнээс гадна, транскрипц ба генийн үйл ажиллагааны хоорондын хамаарлыг алдагдуулдаг транскрипцийн дараах нарийн төвөгтэй механизмууд байдаг. Протеомик судалгаа нь PTM болон уургийн үйл ажиллагааны нөлөөллийн талаар ойлголт өгөх боломжтой боловч тэдгээр нь бага нэвтрүүлэх чадварын аргууд, өндөр дохио-шуугианы харьцаа, муу нягтрал зэрэг бэрхшээлүүдийг дагуулдаг.
Энэ хүрээнд TEM болон MEL ашиглан митохондрийн морфологийг судлах нь митохондрийн динамик ба үйл ажиллагааны хоорондын хамаарал, энэ нь өвчинд хэрхэн нөлөөлдөг талаарх үндсэн асуултуудыг шийдвэрлэхэд ихээхэн боломжтой юм. Хамгийн чухал нь TEM нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал ба динамикийн нэгдмэл төгсгөлийн цэг болох митохондрийн морфологийг хэмжих шууд аргыг олгодог51. MEL нь мөн гурван хэмжээст эсийн орчинд хуваагдал ба нэгдлийн үйл явдлыг дүрслэх шууд аргыг олгодог бөгөөд генийн илэрхийлэлд өөрчлөлт ороогүй байсан ч митохондрийн динамик өөрчлөлтийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох боломжийг олгодог33. Энд бид хоёрдогч митохондрийн өвчний үед митохондрийн дүрслэлийн техникүүдийн ашиг тусыг онцолж байна. Эдгээр өвчин нь ихэвчлэн цочмог митохондрийн гэмтэл биш харин митохондрийн сүлжээний нарийн өөрчлөлтөөр тодорхойлогддог архаг хөнгөн бодисын солилцооны стрессээр тодорхойлогддог. Гэсэн хэдий ч архаг стрессийн үед митозыг хадгалахад шаардлагатай митохондрийн нөхөн төлбөр нь гүн гүнзгий үйл ажиллагааны үр дагавартай байдаг. Мэдрэлийн шинжлэх ухааны хүрээнд эдгээр нөхөн олговрын механизмыг илүү сайн ойлгох нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай холбоотой плейотроп мэдрэлийн эмгэг судлалын талаар чухал мэдээлэл өгч болно.
Эцсийн дүнд бидний өгөгдөл нь мэдрэлийн эсийн митохондрийн динамикийг хянадаг генийн экспресс, уургийн өөрчлөлт, уургийн идэвхжилийн хоорондын нарийн төвөгтэй харилцан үйлчлэлийн үйл ажиллагааны үр дагаврыг ойлгоход дүрслэх аргын ач холбогдлыг онцолж байна. Бид ASD-ийн митохондрийн бүрэлдэхүүн хэсгийн талаар ойлголт авахын тулд мэдрэлийн эсийн загварт митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдлыг загварчлахын тулд PPA ашигласан. PPA-аар эмчилсэн SH-SY5Y эсүүд митохондрийн морфологийн өөрчлөлтийг харуулсан: митохондри жижиг, бөөрөнхий болж, TEM-ээр ажиглахад кристууд муу тодорхойлогдсон байв. MEL шинжилгээгээр эдгээр өөрчлөлтүүд нь бага зэргийн бодисын солилцооны стрессийн хариуд митохондрийн сүлжээг хадгалахын тулд хуваагдал ба нэгдлийн үйл явдлууд нэмэгдэхтэй зэрэгцэн явагддаг болохыг харуулж байна. Түүнээс гадна, PPA нь митохондрийн бодисын солилцоо, гомеостазын транскрипцийн зохицуулалтыг мэдэгдэхүйц алдагдуулдаг. Бид cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, OPA1-ийг PPA стрессээр тасалдсан гол митохондрийн зохицуулагч гэж тодорхойлсон бөгөөд митохондрийн морфологи, үйл ажиллагаанд PPA-аар өдөөгдсөн өөрчлөлтийг зуучлах үүрэг гүйцэтгэж болзошгүй юм. Генийн экспресс болон уургийн идэвхжил, байршил, трансляцийн дараах өөрчлөлтөд PPA-аар өдөөгдсөн цаг хугацааны өөрчлөлтийг илүү сайн тодорхойлохын тулд ирээдүйн судалгаа шаардлагатай байна. Бидний өгөгдөл нь митохондрийн стрессийн хариу урвалыг зуучилдаг зохицуулалтын механизмын нарийн төвөгтэй байдал, харилцан хамаарлыг онцолж, илүү зорилтот механик судалгаанд TEM болон бусад дүрслэлийн техникүүдийн ашиг тусыг харуулж байна.
SH-SY5Y эсийн шугамыг (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich-аас худалдаж авсан. SH-SY5Y эсүүдийг Дулбеккогийн өөрчлөгдсөн Ийгл тэжээлийн орчин/F-12 тэжээлийн холимог (DMEM/F-12) болон L-глутамин (SC09411, ScienCell)-д 25 см2 колбонд 20% ургийн үхрийн ийлдэс (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) болон 1% пенициллин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich)-аар баяжуулсан 25 см2 колбонд 37 °C, 5% CO2-т ургуулсан. Эсүүдийг 0.05% трипсин-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific) ашиглан 80% нэгдэл хүртэл дэд өсгөвөрлөж, 300 г-д центрифугээр ялгаж, ойролцоогоор 7 × 105 эс/мл нягтралтайгаар бүрсэн. Бүх туршилтыг 19-22-р хэсгүүдийн хооронд ялгараагүй SH-SY5Y эсүүд дээр хийсэн. PPA-г NaP хэлбэрээр тарьсан. NaP нунтаг (CAS № 137-40-6, химийн томъёо C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich)-ийг бүлээн MilliQ усанд 1 М концентрацитай болтол уусгаад 4°C-д хадгална. Эмчилгээний өдөр энэ уусмалыг 1 М PPA-тай 3 мМ, 5 мМ PPA-тай ийлдэсгүй орчинд (L-глутаминтай DMEM/F-12) шингэлнэ. Бүх туршилтын эмчилгээний концентраци нь PPA (0 мМ, хяналтын), 3 мМ, болон 5 мМ PPA байсан. Туршилтыг дор хаяж гурван биологийн давталтаар явуулсан.
SH-SY5Y эсүүдийг 25 см5 колбонд 5.5 × 105 эс/мл хурдаар үржүүлж, 24 цагийн турш ургуулсан. PPA эмчилгээг инкубацийн 24 цагийн өмнө колбонд нэмсэн. Хөхтөн амьтдын эдийн дэд өсгөврийн ердийн протоколын дагуу эсийн үрлэнг цуглуулна (дээр тайлбарласан). Эсийн үрлэнг 100 мкл 2.5% глутаральдегид, 1× PBS-д дахин уусгаж, боловсруулалт хүртэл 4°C-д хадгална. SH-SY5Y эсүүдийг богино хугацаанд центрифугээр ялгаж, эсүүдийг үрлэнг хийж, 2.5% глутаральдегид, 1× PBS уусмалыг зайлуулна. Тунадасыг нэрмэл усанд бэлтгэсэн 4% агарозын гельд дахин уусгана (агарозын тунадасны эзэлхүүнтэй харьцуулсан харьцаа 1:1). Агарозын хэсгүүдийг хавтгай тавган дээрх торон дээр байрлуулж, өндөр даралттай хөлдөөхөөс өмнө 1-гексадеценээр бүрсэн. Дээжийг 100% хуурай ацетонд -90°C-д 24 цагийн турш хөлдөөсөн. Дараа нь температурыг -80°C хүртэл нэмэгдүүлж, 1% осмийн тетроксид ба 0.1% глутаральдегидийн уусмал нэмсэн. Дээжийг -80°C-д 24 цагийн турш хадгалсан. Үүний дараа температурыг хэдэн өдрийн турш өрөөний температурт аажмаар нэмэгдүүлсэн: -80°C-аас -50°C хүртэл 24 цагийн турш, -30°C хүртэл 24 цагийн турш, -10°C хүртэл 24 цагийн турш, эцэст нь өрөөний температурт хүргэсэн.
Криоген бэлтгэлийн дараа дээжийг давирхайгаар шингээж, Leica Reichert UltracutS хэт микротом (Leica Microsystems) ашиглан хэт нимгэн хэсгүүдийг (~100 нм) хийсэн. Хэсгүүдийг 2% уранил ацетат болон хар тугалганы цитратаар будсан. Дээжийг 200 кВ-ын хүчдэлд ажилладаг FEI Tecnai 20 дамжуулалтын электрон микроскоп (ThermoFisher (өмнө нь FEI), Эйндховен, Нидерланд) (Lab6 дамжуулагч) болон Tridiem эрчим хүчний шүүлтүүрээр тоноглогдсон Gatan CCD камер (Gatan, UK) ашиглан ажигласан.
Техникийн хуулбар бүрт дор хаяж 24 ширхэг дан эсийн зургийг авсан бөгөөд нийт 266 зураг авсан. Бүх зургийг Сонирхолын Бүс (ROI) макро болон Митохондрийн макро ашиглан шинжилсэн. Митохондрийн макро нь нийтлэгдсэн аргууд дээр суурилсан17,31,32 бөгөөд Фижи/ImageJ69-д TEM зургийг хагас автомат багцаар боловсруулах боломжийг олгодог. Товчхондоо: зургийг өнхрөх бөмбөгний дэвсгэр хасах (60 пикселийн радиус) болон FFT зурвасын шүүлтүүр (тус тус 60 ба 8 пикселийн дээд ба доод хязгаарыг ашиглан) болон 5% -ийн чиглэлийн хүлцэл бүхий босоо шугамын даралтыг ашиглан урвуу болон урвуу байдлаар харуулсан. Боловсруулсан зургийг хамгийн их энтропийн алгоритм ашиглан автоматаар босгож, хоёртын маск үүсгэдэг. Түүхий TEM зурагнаас гараар сонгосон ROI-тэй холбоотой зургийн хэсгүүдийг гаргаж авсан бөгөөд митохондрийн шинж чанарыг тодорхойлж, плазмын мембран болон бусад өндөр тодосгогчтой хэсгүүдийг хассан. Олборлосон ROI бүрийн хувьд 600 пикселээс том хэмжээтэй хоёртын хэсгүүдийг шинжилж, бөөмийн талбай, периметр, гол ба жижиг тэнхлэгүүд, Феретийн диаметр, бөөрөнхий байдал, тойрог байдлыг Fiji/ImageJ-ийн суурилуулсан хэмжилтийн функцуудыг ашиглан хэмжсэн. Merrill, Flippo, and Strack (2017)-ийн дагуу 2-р талбай, бөөмийн харьцаа (гол ба жижиг тэнхлэгийн харьцаа), хэлбэрийн хүчин зүйл (FF)-ийг эдгээр өгөгдлөөс тооцоолсон бөгөөд FF = периметр 2/4pi x талбай. Параметрийн томъёоны тодорхойлолтыг Merrill, Flippo, and Strack (2017)-аас олж болно. Дунджаар PPA эмчилгээ тутамд ойролцоогоор 5,600 бөөмийг шинжилсэн бөгөөд нийтдээ ойролцоогоор 17,000 бөөм байна (өгөгдлийг харуулаагүй болно).
SH-SH5Y эсүүдийг 8 камертай өсгөврийн аяганд (ThermoFisher, #155411) байрлуулж, шөнийн турш наалдалтыг хадгалахын тулд TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) болон Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) будгаар инкубацлав. Зургийг 10 минутын орчинд 405 нм ба 561 нм лазер ашиглан авсан бөгөөд түүхий зургийг 12 цагийн дараалсан цэг дээр зургийн хүрээ хооронд 0.2 μм аз алхамтай 10 зургийн микрограф агуулсан z-стек хэлбэрээр авсан. Зургийг Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 супер нягтралтай платформ (Carl Zeiss, Oberkochen, Герман) ашиглан LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 линз ашиглан цуглуулсан. Зургуудыг өмнө нь тайлбарласан дамжуулах хоолой болон ImageJ залгаасыг ашиглан ImageJ дээр шинжилсэн бөгөөд нэгдэл ба хуваагдлын үйл явдлууд, митохондрийн бүтцийн дундаж тоо, эсийн дундаж митохондрийн эзэлхүүнийг хэмжсэн33. MEL макрог GitHub дээрээс авах боломжтой (Өгөгдлийн бэлэн байдлын мэдэгдлийг үзнэ үү).
SH-SY5Y эсүүдийг эмчилгээ эхлэхээс өмнө 24 цагийн турш зургаан нүхтэй хавтан дээр 0.3 × 106 эс/мл нягтралтайгаар ургуулсан. РНХ-г бага зэрэг өөрчлөлттэйгээр Quick-RNA™ Miniprep протокол (ZR R1055, Zymo Research) ашиглан гаргаж авсан: авахаасаа өмнө нүх бүрт 300 мкл РНХ лизисийн буфер нэмж, эцсийн алхам болгон дээж бүрийг 30 мкл DNase/RNase элюцитэй усаар лизис хийнэ. Бүх дээжийг NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометр ашиглан тоо хэмжээ, чанарыг шалгасан. Эсийн лизатаас гарсан нийт уургийг 200 мкл RIPA лизисийн буфер ашиглан гаргаж авсан бөгөөд уургийн концентрацийг Bradford уургийн шинжилгээгээр тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон70.
кДНХ-ийн нийлэгжилтийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу зарим өөрчлөлттэйгөөр Tetro™ кДНХ-ийн синтезийн хэрэгсэл (BIO-65043, Meridian Bioscience) ашиглан гүйцэтгэсэн. кДНХ-ийг нийт РНХ-ийн 0.7-1 мкг ашиглан 20 мкл урвалд нийлэгжүүлсэн. Праймеруудыг өмнө нь нийтлэгдсэн 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Хүснэгт S1)-ээс сонгож, дагалдах зондыг Integrated DNA Technologies-ийн PrimerQuest хэрэгслийг ашиглан зохион бүтээсэн. Сонирхож буй бүх генийг цөмийн B2M генд хэвийн болгосон. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC болон OPA1-ийн генийн экспрессийг RT-qPCR ашиглан хэмжсэн. Мастер холимогт LUNA Taq полимераза (M3003L, New England Biolabs), 10 μM урагш ба урвуу праймерууд, кДНХ, PCR зэрэглэлийн ус багтсан бөгөөд урвал бүрийн хувьд 10 μL эцсийн эзэлхүүнийг гаргаж авсан. Хуваах ба хуваагдлын генийн экспрессийг (DRP1, MFN1/2) TaqMan мультиплекс шинжилгээ ашиглан хэмжсэн. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs)-ийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу бага зэрэг өөрчлөлттэйгээр ашигласан. Мультиплекс RT-qPCR мастер холимогт 1X LUNA Taq полимераза, 10 μM урагш ба урвуу праймерууд, 10 μM зонд, кДНХ, PCR зэрэглэлийн ус багтсан бөгөөд урвал бүрийн хувьд 20 μL эцсийн эзэлхүүн гарсан. RT-qPCR-ийг Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—серийн дугаар: R0618110) ашиглан гүйцэтгэсэн. Циклийн нөхцөлийг S1 хүснэгтэд үзүүлэв. Бүх кДНХ-ийн дээжийг гурвалсан байдлаар олшруулж, арав дахин шингэрүүлэлтийн цувралыг ашиглан стандарт муруй үүсгэсэн. Циклийн босго стандарт хазайлт (Ct) >0.5 бүхий гурвалсан дээжийн гадуурх утгыг өгөгдлийн давтагдах байдлыг хангахын тулд шинжилгээнээс хассан30,72. Харьцангуй генийн экспрессийг 2-ΔΔCt79 аргыг ашиглан тооцоолсон.
Уургийн дээжийг (60 мкг) Laemmli ачааллын буфертай 2:1 харьцаатай хольж, 12% өнгөгүй уургийн гель (Bio-Rad #1610184) дээр ажиллуулсан. Уургуудыг Trans-Blot Turbo систем (#170-4155, Bio-Rad) ашиглан PVDF (поливинилиден фторид) мембран (#170-84156, Bio-Rad) руу шилжүүлсэн. Мембраныг хааж, зохих анхдагч эсрэгбие (OPA1, MFN1, MFN2, болон DRP1)-ээр 48 цагийн турш (1:1000 шингэрүүлсэн) өсгөвөрлөж, дараа нь хоёрдогч эсрэгбие (1:10,000)-ээр 1 цагийн турш өсгөвөрлөв. Дараа нь мембраныг Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) ашиглан дүрслэн авч, Bio-Rad ChemiDoc MP систем ашиглан тэмдэглэсэн. ImageLab хувилбар 6.1-ийг Western blot шинжилгээнд ашигласан. Анхны гель болон толбыг Зураг S1-д үзүүлэв. Эсрэгбиеийн мэдээллийг Хүснэгт S2-т үзүүлэв.
Өгөгдлийн багцыг дор хаяж гурван бие даасан дээжийн дундаж утгын (SEM) дундаж болон стандарт алдаа хэлбэрээр үзүүлэв. Өгөгдлийн багцыг Гауссын тархалт болон тэнцүү стандарт хазайлт гэж үзэж, шинжилгээг үргэлжлүүлэхийн өмнө Шапиро-Вилксийн тестийг (өөрөөр заагаагүй бол) ашиглан хэвийн эсэхийг шалгасан. Ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд Фишерийн MEL LSD (p < 0.05), нэг талын ANOVA (эмчилгээний эсрэг хяналтын дундаж) болон Даннеттын олон харьцуулалтын тестийг ашиглан өгөгдлийн багцыг шинжлэхээс гадна (p < 0.05). Ач холбогдол бүхий p утгуудыг графикт *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 гэж харуулав. Бүх статистикийн шинжилгээ болон графикийг GraphPad Prism 9.4.0 ашиглан гүйцэтгэж, үүсгэсэн.
TEM дүрсний шинжилгээнд зориулсан Fiji/ImageJ макро нь GitHub дээр олон нийтэд нээлттэй байна: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Митохондрийн үйл явдлын байршлын тэмдэглэгч (MEL) макро нь GitHub дээр олон нийтэд нээлттэй байна: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви НМ болон Вижая А. Митохондриа: бодисын солилцоо, гомеостаз, стресс, хөгшрөлт ба эпигенетикийн гол зохицуулагчид. Индонези. Биоанагаахын шинжлэх ухаан. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шизофрени өвчний үед олон талт митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал, I цогцолбор нь эмгэг судлалын бай болох магадлалтай. Шизофрени. эх сурвалж. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. болон Бил, MF Паркинсоны өвчний үеийн митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал. Мэдрэлийн химийн сэтгүүл. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сингх Т.Г., Мехта В. Стресстэй митохондри: Альцгеймерийн өвчний үед халдварын бай. Митохондриа 59, 48–57 (2021).
Беленгуэр П., Дуарте ЖМН, Шук ПФ болон Феррейра Г.К. Митохондриа ба тархи: биоэнергетик ба бусад. Нейротоксин. нөөц. 36, 219–238 (2019).
Рангаражу, В. нар. Плейотроп митохондри: митохондрийн мэдрэлийн эсийн хөгжил ба өвчинд үзүүлэх нөлөө. Мэдрэл судлалын сэтгүүл. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьо-Рамос, К. ба Морайс, В.А. Нейроны эсийн митохондрийн биогенез: хэрхэн, хаана. Олон улсын шинж чанар. Ж. Мор. шинжлэх ухаан. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендал, У., Нистер, М. болон Жао, Ж. Хөхтөн амьтдын митохондрийн динамикийн зохицуулалт: боломжууд ба бэрхшээлүүд. урд тал. дотоод шүүрлийн систем. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. болон Слэк, РС Нейрогенезийн зохицуулалт дахь митохондрийн динамик: хөгжиж буй үеэс насанд хүрэгчдийн тархи хүртэл. хөгжил. динамик. 247, 47–53 (2018).