Одоо *Одоогийн хаяг: Герман улсын Кёльн хот, 50931, Хөгшрөлттэй холбоотой өвчний үед эсийн стрессийн хариу урвалын талаархи Кёльний шилдэг кластерын судалгаа (CECAD).
Митохондрийн өвчний мэдрэлийн эсийн доройтлыг эргэлт буцалтгүй гэж үздэг, учир нь мэдрэлийн эсийн бодисын солилцооны уян хатан чанар хязгаарлагдмал боловч митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал нь бие махбод дахь мэдрэлийн эсийн бодисын солилцооны эсийн бие даасан байдалд үзүүлэх нөлөөг сайн ойлгоогүй байна. Энд бид митохондрийн нэгдлийн динамикийн тасалдлаас үүдэлтэй OXPHOS-ийн дутагдалтай даамжирсан Пуркинье мэдрэлийн эсийн эсийн өвөрмөц протеомыг танилцуулж байна. Бид митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал нь протеомикийн салбарт гүнзгий өөрчлөлтийг өдөөж, улмаар эсийн үхлийн өмнө нарийн бодисын солилцооны хөтөлбөрүүдийг дараалан идэвхжүүлэхэд хүргэсэн болохыг тогтоожээ. Гэнэтийн байдлаар бид пируват карбоксилаза (PCx) болон TCA мөчлөгийн завсрын бүтээгдэхүүнийг нөхдөг бусад хөгшрөлтийн эсрэг ферментүүдийн илэрхий индукцийг тодорхойлсон. PCx-ийг дарангуйлах нь исэлдэлтийн стресс болон мэдрэлийн эсийн доройтлыг улам хүндрүүлж, атеросклероз нь OXPHOS дутагдалтай мэдрэлийн эсүүдэд хамгаалалтын нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна. Эцсийн доройтсон мэдрэлийн эсүүдэд митохондрийн нэгдлийг сэргээх нь эдгээр бодисын солилцооны шинж чанарыг бүрэн өөрчилж, улмаар эсийн үхлээс сэргийлдэг. Бидний олдворууд нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд тэсвэртэй байдлыг олгодог өмнө нь мэдэгдэж байгаагүй замыг тодорхойлж, мэдрэлийн эсийн доройтлыг өвчний хожуу үе шатанд ч буцаах боломжтойг харуулж байна.
Хүний митохондрийн өвчинтэй холбоотой мэдрэлийн эсийн энергийн солилцоог хадгалахад митохондрийн гол үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг өргөн хүрээтэй мэдрэлийн шинж тэмдгүүд онцолж байна. Эдгээр өвчний ихэнх нь митохондрийн генийн экспрессийг зохицуулдаг генийн мутаци (1, 2) эсвэл митохондрийн динамиктай холбоотой генийн устгалаас үүдэлтэй бөгөөд энэ нь митохондрийн ДНХ (mtDNA)-ийн тогтвортой байдалд шууд бусаар нөлөөлдөг (3, 4). Амьтны загварт хийсэн судалгаагаар хүрээлэн буй эдэд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд хариу үйлдэл үзүүлэхийн тулд консерватив бодисын солилцооны замууд (5-7) идэвхжиж болох бөгөөд энэ нь эдгээр нарийн төвөгтэй өвчний эмгэг жамыг гүнзгий ойлгоход чухал мэдээлэл өгдөг болохыг харуулсан. Үүний эсрэгээр тархины митохондрийн аденозин трифосфат (ATP) үйлдвэрлэлийн ерөнхий бүтэлгүйтлээс үүдэлтэй тодорхой эсийн төрлүүдийн бодисын солилцооны өөрчлөлтийн талаарх бидний ойлголт нь үндсэн зүйл юм (8), энэ нь өвчнийг урьдчилан сэргийлэх эсвэл урьдчилан сэргийлэхэд ашиглаж болох эмчилгээний зорилтуудыг тодорхойлох шаардлагатайг онцолж байна. Мэдрэлийн доройтлоос урьдчилан сэргийлэх (9). Мэдрэлийн эсүүд нь хүрээлэн буй эд эсийн төрлүүдтэй харьцуулахад бодисын солилцооны уян хатан чанар маш хязгаарлагдмал гэж өргөнөөр үздэг нь мэдээллийн хомсдол юм (10). Эдгээр эсүүд нь синаптик дамжуулалтыг дэмжих, гэмтэл, өвчний нөхцөлд хариу үйлдэл үзүүлэх зорилгоор мэдрэлийн эсүүдэд метаболит нийлүүлэхийг зохицуулахад гол үүрэг гүйцэтгэдэг тул эсийн бодисын солилцоог тархины эдийн хүнд нөхцөлд дасан зохицох чадвар нь глиал эсүүдээр бараг хязгаарлагддаг (11-14). Үүнээс гадна, тархины эдийн төрөлхийн эсийн олон янз байдал нь мэдрэлийн эсийн тодорхой дэд бүлгүүдэд тохиолддог бодисын солилцооны өөрчлөлтийг судлахад ихээхэн саад болдог. Үүний үр дүнд мэдрэлийн эсүүдэд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал нь эсийн болон бодисын солилцооны яг тодорхой үр дагаврын талаар бага мэдээлэлтэй байдаг.
Митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалын бодисын солилцооны үр дагаврыг ойлгохын тулд бид митохондрийн гаднах мембраны нэгдэл (Mfn2)-ийн эвдрэлээс үүдэлтэй мэдрэлийн эсийн доройтлын янз бүрийн үе шатанд Пуркинье мэдрэлийн эсүүдийг (PN) тусгаарласан. Хүний Mfn2 мутаци нь Шаркот-Мари-Тут 2A төрөл (15) гэгддэг удамшлын мотор мэдрэхүйн мэдрэлийн эмгэгийн нэг хэлбэртэй холбоотой боловч хулганад Mfn2-ийн нөхцөлт устгал нь исэлдэлтийн фосфоржуулалтын (OXPHOS) үйл ажиллагааны алдагдалыг өдөөх сайн хүлээн зөвшөөрөгдсөн арга юм. Мэдрэлийн янз бүрийн дэд хэвшмэлүүд (16-19) болон үүнээс үүдэлтэй мэдрэлийн эсийн доройтлын фенотип нь хөдөлгөөний эмгэг (18, 19) эсвэл тархины атакси (16) зэрэг мэдрэлийн эсийн даамжрах шинж тэмдгүүд дагалддаг. Шошгогүй тоон (LFQ) протеомик, метаболомик, дүрслэл, вирусологийн аргуудыг хослуулан ашигласнаар бид даамжрах мэдрэлийн эсийн доройтол нь пируват карбоксилаза (PCx) болон PN-ийн артериосклерозтой холбоотой бусад хүчин зүйлсийг in vivo нөхцөлд хүчтэй өдөөдөг болохыг харуулж байна. Ферментийн илэрхийлэл. Энэхүү олдворын хамаарлыг баталгаажуулахын тулд бид Mfn2 дутагдалтай PN-д PCx-ийн экспрессийг тусгайлан бууруулж, энэ мэс засал нь исэлдэлтийн стрессийг нэмэгдүүлж, мэдрэлийн эсийн доройтлыг хурдасгадаг болохыг тогтоожээ. Ингэснээр азоосперми нь эсийн үхэлд бодисын солилцооны дасан зохицох чадварыг олгодог болохыг нотолсон. MFN2-ийн хүнд экспресс нь OXPHOS-ийн хүнд дутагдал, митохондрийн ДНХ-ийн их хэмжээний хэрэглээ, митохондрийн сүлжээ тасарсан мэт харагдах терминалын доройтлын PN-ийг бүрэн аварч чаддаг бөгөөд энэ нь мэдрэлийн эсийн доройтлын энэ хэлбэр нь эсийн үхлийн өмнө өвчний хүнд үе шатанд ч сэргэж болохыг онцолж байна.
Mfn2 нокаут PN-үүдийн митохондриаг дүрслэн харуулахын тулд бид Cre-хамааралтай митохондрид шар флуоресцент уураг (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессийг чиглүүлэх боломжийг олгодог хулганы омгийг ашиглаж, митохондрийн морфологийг in vivo шалгасан. Бид PN-үүдэд Mfn2 генийг устгах нь митохондрийн сүлжээг аажмаар хуваахад хүргэдэг болохыг тогтоосон (Зураг S1A) бөгөөд хамгийн эртний өөрчлөлт нь 3 долоо хоногтойд илэрсэн. Үүний эсрэгээр, Калбиндины дархлааны будалт алдагдсанаар нотлогдсон PN эсийн давхаргын мэдэгдэхүйц доройтол нь 12 долоо хоногтойд хүртэл эхлээгүй (Зураг 1, А ба Б). Митохондрийн морфологийн хамгийн эртний өөрчлөлтүүд болон мэдрэлийн эсийн үхлийн харагдахуйц эхлэлийн хоорондох цаг хугацааны зөрүү нь биднийг эсийн үхлийн өмнө митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалаас үүдэлтэй бодисын солилцооны өөрчлөлтийг судлахад хүргэсэн. Бид YFP (YFP+) илэрхийлэгч PN-г (Зураг 1C) болон хяналтын хулгануудад (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ялгах флуоресценцийн идэвхжүүлсэн эсийн ялгах (FACS) дээр суурилсан стратеги боловсруулсан бөгөөд цаашид CTRL гэж нэрлэнэ (Зураг S1B). YFP дохионы харьцангуй эрчимд суурилсан хаалганы стратегийг оновчлох нь бидэнд YFP+ биеийг (YFPhigh) PN бус (YFPneg) (Зураг S1B) эсвэл флуоресцент аксон/дендрит хэлтэрхий (YFPlow; Зураг S1D, зүүн талд) PN-ээс цэвэрлэх боломжийг олгодог бөгөөд энэ нь конфокал микроскопоор баталгаажсан (Зураг S1D, баруун талд). Ангилагдсан популяцийн ижил төстэй байдлыг баталгаажуулахын тулд бид LFQ протеомик, дараа нь үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ хийж, YFPhigh болон YFPneg эсүүдийн хооронд тодорхой ялгаа байгааг тогтоосон (Зураг S1C). YFPhigh эсүүд нь мэдэгдэж буй PN маркеруудын (жишээ нь Calb1, Pcp2, Grid2 болон Itpr3) цэвэр баяжуулалтыг харуулсан (21, 22) боловч мэдрэлийн эсүүд болон бусад эсийн төрлүүдэд түгээмэл илэрхийлэгддэг уургуудын баяжуулалт хийгдээгүй (Зураг 1D)). Бие даасан туршилтаар цуглуулсан ангилсан YFPhigh эсүүдийн дээжийг харьцуулах нь корреляцийн коэффициент > 0.9 байгааг харуулсан бөгөөд энэ нь биологийн давталтуудын хооронд сайн нөхөн үржих чадварыг харуулж байна (Зураг S1E). Товчхондоо, эдгээр өгөгдөл нь боломжтой PN-ийг цочмог болон өвөрмөц тусгаарлах төлөвлөгөөг маань баталгаажуулсан. Ашигласан L7-cre драйвер систем нь төрсний дараах эхний долоо хоногт мозайк рекомбинацийг өдөөдөг тул (23) бид CTRL болон нөхцөлт (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейронуудыг цуглуулах хулгануудыг устгаж эхэлсэн. Рекомбинаци дууссаны дараа үүнийг 4 долоо хоногтойд нь Mfn2cKO гэж нэрлэдэг. Эцсийн цэг болгон бид митохондрийн хуваагдал илэрхий байсан ч PN давхарга бүрэн бүтэн байх 8 долоо хоногтой насыг сонгосон (Зураг 1B ба Зураг S1A). Нийтдээ бид нийт 3013 уургийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон бөгөөд үүний 22 орчим хувь нь митохондрийн протеомыг митохондри гэж үндэслэн MitoCarta 2.0 тэмдэглэгээнд үндэслэсэн (Зураг 1E) (Зураг 1E) (24). 8 дахь долоо хоногт хийсэн дифференциал генийн экспрессийн шинжилгээгээр бүх уургийн зөвхөн 10.5% нь мэдэгдэхүйц өөрчлөлттэй байсан (Зураг 1F ба Зураг S1F), үүнээс 195 уураг буурсан, 120 уураг дээшлүүлсэн (Зураг 1F). Энэхүү өгөгдлийн багцын "шинэлэг замын шинжилгээ" нь дифференциалаар илэрхийлэгдсэн генүүд нь голчлон тодорхой бодисын солилцооны замын хязгаарлагдмал багцад хамаардаг болохыг харуулж байгааг тэмдэглэх нь зүйтэй (Зураг 1G). Сонирхолтой нь, OXPHOS болон кальцийн дохиололтой холбоотой замын зохицуулалт буурсан нь нэгдлийн дутагдалтай PN-д митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдал үүсч байгааг баталж байгаа ч амин хүчлийн солилцоог голчлон хамардаг бусад ангиллууд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн нь митохондрийн PN-д тохиолддог бодисын солилцоотой нийцэж байна. Дахин холболт нь тогтвортой үйл ажиллагааны алдагдал юм.
(A) CTRL болон Mfn2cKO хулгануудын тархины хэсгүүдийн төлөөллийн конфокал гэрэл зургууд нь PN-ийн аажмаар алдагдлыг харуулж байна (кальбиндин, саарал); цөмүүдийг DAPI-ээр будсан. (B) (A)-ийн тоон үзүүлэлт (дисперсийн нэг талын шинжилгээ, ***P<0.001; n = гурван хулганаас 4-6 тойрог). (C) Туршилтын ажлын урсгал. (D) Пуркинье (дээд) болон бусад эсийн төрлүүдэд (дунд) өвөрмөц маркеруудын дулааны газрын зургийн тархалт. (E) Ангилагдсан PN-д тодорхойлогдсон митохондрийн уургийн тоог харуулсан Веннийн диаграмм. (F) 8 долоо хоногт Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүдэд ялгаварлан илэрхийлэгдсэн уургуудын галт уулын график (ач холбогдлын хязгаарын утга 1.3). (G) Бүтээлч байдлын замын шинжилгээ нь 8 долоо хоног гэж ангилагдсан Mfn2cKO PN-ийн хамгийн чухал таван дээш зохицуулалт (улаан) ба доош зохицуулалт (цэнхэр) замыг харуулж байна. Илэрсэн уураг бүрийн дундаж илэрхийллийн түвшинг харуулав. Саарал өнгийн дулааны газрын зураг: тохируулсан P утга. нс, чухал биш.
Протеомикийн өгөгдлүүдээс харахад I, III, IV цогцолборуудын уургийн илэрхийлэл аажмаар буурсан байна. I, III, IV цогцолборууд бүгд mtDNA-ээр кодлогдсон чухал дэд нэгжүүдийг агуулсан байсан бол зөвхөн цөмд кодлогдсон II цогцолбор нь бараг өөрчлөгдөөгүй байв (Зураг 2A ба Зураг S2A). . Протеомикийн үр дүнтэй нийцүүлэн, тархины эдийн хэсгүүдийн иммуногистохимийн судалгаагаар PN дахь IV цогцолборын MTCO1 (митохондрийн цитохром С оксидазын дэд нэгж 1) дэд нэгжийн түвшин аажмаар буурсан болохыг харуулсан (Зураг 2B). mtDNA-ээр кодлогдсон Mtatp8 дэд нэгж мэдэгдэхүйц буурсан (Зураг S2A), харин цөмд кодлогдсон ATP синтазын дэд нэгжийн тогтвортой төлөвийн түвшин өөрчлөгдөөгүй хэвээр байгаа нь mtDNA-ийн илэрхийлэл тогтвортой байх үед мэдэгдэж буй тогтвортой ATP синтазын дэд угсралт F1 цогцолбортой нийцэж байна. Үүсэлт нь тогтвортой байна. Тасалдал (7). Эрэмбэлэгдсэн Mfn2cKO PN-үүдийн mtDNA түвшинг бодит цагийн полимеразын гинжин урвал (qPCR)-ээр үнэлэхэд mtDNA хуулбарын тоо аажмаар буурч байгааг баталсан. Хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад 8 долоо хоногтойд mtDNA түвшний зөвхөн 20% орчим нь хадгалагдсан (Зураг 2C). Эдгээр үр дүнтэй нийцүүлэн Mfn2cKO PN-үүдийн конфокал микроскопийн будалтыг ДНХ-ийг илрүүлэхэд ашигласан бөгөөд энэ нь митохондрийн нуклеотидын цаг хугацаанаас хамааралтай хэрэглээг харуулж байна (Зураг 2D). Бид митохондрийн уургийн задрал болон стрессийн хариу урвалд оролцдог зарим нэр дэвшигчид, түүний дотор Lonp1, Afg3l2 болон Clpx, мөн OXPHOS цогцолборын угсралтын хүчин зүйлс нэмэгдсэн болохыг тогтоосон. Апоптозод оролцдог уургийн түвшинд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт илрээгүй (Зураг S2B). Үүнтэй адилаар бид кальцийн тээвэрлэлтэд оролцдог митохондри ба эндоплазмын торлог сувгууд бага зэргийн өөрчлөлттэй байгааг тогтоосон (Зураг S2C). Үүнээс гадна, аутофагитай холбоотой уургуудын үнэлгээнд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гараагүй бөгөөд энэ нь иммуногистохими болон электрон микроскопоор in vivo ажиглагдсан аутофагосомын харагдахуйц индукцтэй нийцэж байна (Зураг S3). Гэсэн хэдий ч PN-д OXPHOS-ийн үйл ажиллагааны алдагдал нь илэрхий хэт бүтцийн митохондрийн өөрчлөлтүүд дагалддаг. 5 ба 8 долоо хоногтой Mfn2cKO PN-ийн эсийн бие болон дендрит модноос митохондрийн бөөгнөрөл харагдаж болох бөгөөд дотор мембраны бүтэц гүнзгий өөрчлөлтөд орсон (Зураг S4, A ба B). Эдгээр хэт бүтцийн өөрчлөлт болон mtDNA-ийн мэдэгдэхүйц бууралттай нийцүүлэн тархины цочмог зүсмэлүүдийг тетраметилродамин метил эфир (TMRM)-ээр шинжлэхэд Mfn2cKO PN-д митохондрийн мембраны потенциал мэдэгдэхүйц буурсан болохыг харуулсан (Зураг S4C).
(A) OXPHOS цогцолборын экспрессийн түвшний хугацааны явцын шинжилгээ. Зөвхөн 8 долоо хоногт P<0.05 бүхий уургуудыг авч үзье (хоёр талын ANOVA). Цэгтэй шугам: CTRL-тэй харьцуулахад тохируулга хийгдээгүй. (B) Зүүн талд: MTCO1 эсрэгбиетэй шошготой тархины хэсгийн жишээ (масштабын багана, 20 μм). Пуркинье эсийн биетүүдийн эзэлсэн талбайг шар өнгөөр ​​хучсан. Баруун талд: MTCO1 түвшинг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (дисперсийн нэг талын шинжилгээ; гурван хулганаас шинжилсэн n = 7-20 эс). (C) Эрэмбэлэгдсэн PN дахь mtDNA хуулбарын тооны qPCR шинжилгээ (дисперсийн нэг талын шинжилгээ; n = 3-7 хулгана). (D) Зүүн талд: ДНХ-ийн эсрэгбиетэй шошготой тархины хэсгийн жишээ (масштабын багана, 20 μм). Пуркинье эсийн биетүүдийн эзэлсэн талбайг шар өнгөөр ​​хучсан. Баруун талд: mtDNA гэмтлийн тоон үзүүлэлт (дисперсийн нэг талын шинжилгээ; гурван хулганаас 5-9 эс). (E) Бүхэл эсийн хавчаар бичлэгт митоYFP + Пуркинье эсүүдийг харуулсан цочмог тархины хэсгийн жишээ (сум). (F) IV муруйн тоон үзүүлэлт. (G) CTRL болон Mfn2cKO Пуркинье эсүүдэд деполяризацийн гүйдлийн тарилгын төлөөллийн бичлэг. Дээд ул мөр: AP-г өдөөсөн анхны импульс. Доод ул мөр: AP-ийн хамгийн их давтамж. (H) Синаптикийн дараах аяндаа оролтын (sPSP) тоон үзүүлэлт. Бичлэгийн төлөөллийн ул мөр болон түүний томруулах харьцааг (I)-д үзүүлэв. Гурван хулганаас n = 5-20 эсийг шинжилсэн дисперсийн нэг талын шинжилгээ. Өгөгдлийг дундаж ± SEM гэж илэрхийлнэ; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Цоолсон хавчаар горимыг ашиглан бүртгэгдсэн аяндаа AP-ийн төлөөллийн ул мөр. Дээд ул мөр: AP-ийн хамгийн их давтамж. Доод ул мөр: ганц AP-ийн томруулалт. (K) (J)-ийн дагуу дундаж ба хамгийн их AP давтамжийг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлнэ үү. Манн-Уитнигийн тест; дөрвөн хулганаас n = 5 эсийг шинжилсэн. Өгөгдлийг дундаж ± SEM гэж илэрхийлнэ; чухал биш.
8 долоо хоногтой Mfn2cKO PN-д OXPHOS-ийн илэрхий гэмтэл илэрсэн нь мэдрэлийн эсүүдийн физиологийн үйл ажиллагаа ноцтой хэвийн бус байгааг харуулж байна. Тиймээс бид цочмог тархины зүсмэлүүдэд бүхэл эсийн хавчаар бичлэг хийж 4-5 долоо хоног, 7-8 долоо хоногт OXPHOS дутагдалтай мэдрэлийн эсүүдийн идэвхгүй цахилгаан шинж чанарыг шинжилсэн (Зураг 2E). Гэнэтийн байдлаар, Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүдийн дундаж амрах мембраны потенциал ба оролтын эсэргүүцэл нь хяналтын бүлэгтэй төстэй байсан ч эсүүдийн хооронд нарийн ялгаа байсан (Хүснэгт 1). Үүнтэй адилаар, 4-5 долоо хоногтойд гүйдэл-хүчдэлийн хамааралд (IV муруй) мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гараагүй (Зураг 2F). Гэсэн хэдий ч 7-8 долоо хоногтой Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүд IV горимд (гиперполяризацийн алхам) амьд үлдээгүй бөгөөд энэ нь энэ хожуу үе шатанд гиперполяризацийн потенциалд тодорхой мэдрэмтгий байгааг харуулж байна. Үүний эсрэгээр, Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүдэд давтагдах үйлчлэлийн потенциал (AP) цэнэг алдалтыг үүсгэдэг деполяризацийн гүйдэл сайн тэсвэрлэгддэг бөгөөд энэ нь тэдний нийт цэнэг алдалтын хэв маяг нь 8 долоо хоногтой хяналтын мэдрэлийн эсүүдээс мэдэгдэхүйц ялгаатай биш болохыг харуулж байна (Хүснэгт 1 ба Зураг 2G). Үүнтэй адилаар аяндаа үүсэх постсинаптик гүйдлийн (sPSC) давтамж ба далайц нь хяналтын бүлгийнхтэй харьцуулж болох байсан бөгөөд үйл явдлын давтамж 4 долоо хоногоос 5 долоо хоногоос 7 долоо хоногоос 8 долоо хоног хүртэл нэмэгдэж, ижил төстэй өсөлттэй байв (Зураг 2, H ба I). PN-д синаптик боловсорч гүйцэх хугацаа (25). Цоолсон PN нөхөөсний дараа ижил төстэй үр дүнг олж авсан. Энэхүү тохиргоо нь эсийн ATP согогийг нөхөн төлжүүлэх боломжийг сэргийлдэг бөгөөд энэ нь бүхэл эсийн нөхөөс хавчаарын бичлэгт тохиолдож болно. Ялангуяа Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүдийн амрах мембраны потенциал ба аяндаа асах давтамж нөлөөлөөгүй (Зураг 2, J ба K). Товчхондоо, эдгээр үр дүнгүүд нь OXPHOS-ийн илэрхий үйл ажиллагааны алдагдалтай PN нь өндөр давтамжийн цэнэгийн хэв маягийг сайн даван туулж чаддаг болохыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь тэдэнд бараг хэвийн электрофизиологийн хариу урвалыг хадгалах боломжийг олгодог нөхөн олговрын механизм байгааг харуулж байна.
Өгөгдлийг дундаж ± SEM (дисперсийн нэг талын шинжилгээ, Холм-Сидакийн олон харьцуулалтын тест; *P<0.05) гэж илэрхийлнэ. Нэгжийн дугаарыг хаалтанд тэмдэглэнэ.
Бид протеомикийн өгөгдлийн багцын аль нэг ангилалд (Зураг 1G) OXPHOS-ийн хүнд хэлбэрийн дутагдлыг нөхөж чадах замууд байгаа эсэхийг судлахаар зорьсон бөгөөд ингэснээр нөлөөлөлд өртсөн PN нь яагаад бараг хэвийн электрофизиологийг хадгалж чаддагийг тайлбарласан (Зураг 2, E-ээс K хүртэл). . Протеомикийн шинжилгээгээр салаалсан гинжин амин хүчлүүдийн (BCAA) катаболизмд оролцдог ферментүүд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 3A ба Зураг S5A) бөгөөд эцсийн бүтээгдэхүүн болох ацетил-КоА (CoA) буюу сукцинил КоА нь артериосклерозын хүчил (TCA) мөчлөгийн трикарбоксилатуудыг нөхөж чаддаг болохыг харуулсан. Бид BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) болон BCAT2-ийн агууламж хоёулаа нэмэгдсэн болохыг тогтоосон. Тэд α-кетоглютаратаас глутамат үүсгэснээр BCAA катаболизмын эхний алхамыг хурдасгадаг (26). Салаалсан гинжин кето хүчлийн дегидрогеназа (BCKD) цогцолборыг бүрдүүлдэг бүх дэд нэгжүүд нь зохицуулалт сайжирсан (цогцолбор нь үүссэн BCAA нүүрстөрөгчийн араг ясны дараагийн болон эргэлт буцалтгүй декарбоксилизацийг хурдасгадаг) (Зураг 3A ба Зураг S5A). Гэсэн хэдий ч эрэмбэлэгдсэн PN-д BCAA-д тодорхой өөрчлөлт гараагүй бөгөөд энэ нь эдгээр чухал амин хүчлүүдийн эсийн шингээлт нэмэгдсэн эсвэл TCA мөчлөгийг нөхөхийн тулд бусад эх үүсвэр (глюкоз эсвэл сүүн хүчил) ашигласантай холбоотой байж болох юм (Зураг S5B). OXPHOS дутагдалтай PN-үүд нь 8 долоо хоногтойдоо глутамины задрал болон трансаминацийн идэвхжил нэмэгдсэнийг харуулсан бөгөөд үүнийг митохондрийн фермент глутаминаза (GLS) болон глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2)-ийн зохицуулалт нэмэгдсэнээр харуулж болно (Зураг 3, A ба C). GLS-ийн өсөлт нь залгагдсан изоформ глутаминаза С (GLS-GAC)-аар хязгаарлагддаг (Mfn2cKO/CTRL-ийн өөрчлөлт ойролцоогоор 4.5 дахин, P = 0.05) бөгөөд хорт хавдрын эдэд түүний өвөрмөц өсөлт нь митохондрийн биоэнергийг дэмжиж чаддаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. (27).
(A) Дулааны зураглал нь 8 долоо хоногийн хугацаанд тодорхойлсон маршрутын уургийн түвшний атирааны өөрчлөлтийг харуулж байна. (B) PCx эсрэгбие (масштабын баар, 20 μм)-аар тэмдэглэгдсэн тархины зүсмэлийн жишээ. Шар сум нь Пуркинье эсийн бие рүү заана. (C) Атеросклерозын чухал нэр дэвшигч гэж тодорхойлсон хугацааны явцын уургийн экспрессийн шинжилгээ (олон t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 хулгана). (D) Дээр: [1-13C]пируват ул мөрд агуулагдах тэмдэглэгдсэн нүүрстөрөгчийг оруулах янз бүрийн аргыг харуулсан бүдүүвч диаграмм (өөрөөр хэлбэл PDH эсвэл транс-артерийн замаар). Доод талд: Хийлчийн диаграмм нь цочмог тархины зүсмэлүүдийг [1-13C]пируватаар тэмдэглэсний дараа аспартын хүчил, нимбэгийн хүчил, алимны хүчил болж хувирсан дан тэмдэглэгдсэн нүүрстөрөгчийн (M1) хувийг харуулж байна (хос t-тест; ** P <0.01). (E) Заасан замын цогц цагийн түүхийн шинжилгээ. Зөвхөн 8 долоо хоногт P<0.05-тай уургуудыг авч үзнэ үү. Тасархай шугам: тохируулгын утга байхгүй (дисперсийн хоёр талын шинжилгээ; * P <0.05; *** P <0.001). Өгөгдлийг дундаж ±SEM гэж илэрхийлнэ.
Бидний дүн шинжилгээнд BCAA катаболизм нь гол дээшлэх зохицуулалтын замуудын нэг болсон. Энэ баримт нь OXPHOS дутагдалтай PN-д TCA мөчлөгт орж буй агааржуулалтын хэмжээ өөрчлөгдөж болохыг хүчтэй харуулж байна. Энэ нь мэдрэлийн эсийн бодисын солилцооны дахин холболтын гол хэлбэрийг илэрхийлж болох бөгөөд энэ нь OXPHOS-ийн хүнд хэлбэрийн үйл ажиллагааны алдагдлыг хадгалах үед мэдрэлийн эсийн физиологи болон амьд үлдэхэд шууд нөлөөлж болзошгүй юм. Энэхүү таамаглалтай нийцүүлэн бид атеросклерозын эсрэг гол фермент PCx нь дээшлэх зохицуулалттай (Mfn2cKO/CTRL ойролцоогоор 1.5 дахин өөрчлөгддөг; Зураг 3A) болохыг тогтоосон бөгөөд энэ нь пируватыг оксалоацетат болгон хувиргахыг хурдасгадаг (28) бөгөөд энэ нь тархины эдэд байдаг гэж үздэг. ийн илэрхийлэл нь астроцитоор хязгаарлагддаг (29, 30). Протеомикийн үр дүнтэй нийцүүлэн конфокал микроскопоор PCx илэрхийлэл нь OXPHOS дутагдалтай PN-д тодорхой бөгөөд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн бол PCx-ийн урвалд орох чадвар нь голчлон хяналтын Бергманн глиал эсүүдээр хязгаарлагдсан болохыг харуулсан (Зураг 3B). PCx-ийн ажиглагдсан өсөлтийг функциональ байдлаар шалгахын тулд бид цочмог тархины зүсмэлүүдийг [1-13C]пируват ул мөрөөр эмчилсэн. Пируватыг пируватдегидрогеназа (PDH)-аар исэлдүүлэхэд түүний изотопын шошго алга болсон боловч пируват судасны урвалаар метаболизмд ороход TCA мөчлөгийн завсрын бүтээгдэхүүнд нэгддэг (Зураг 3D). Протеомикийн өгөгдлөө дэмжих зорилгоор бид Mfn2cKO зүсмэлүүдийн аспартын хүчилд энэхүү ул мөрөөс олон тооны маркер ажигласан бол нимбэгийн хүчил ба алимны хүчил нь дунд зэргийн хандлагатай байсан ч мэдэгдэхүйц биш байсан (Зураг 3D).
МитоПарк хулгануудын допамин мэдрэлийн эсүүд митохондрийн транскрипцийн хүчин зүйл А генийг (Tfam) тусгайлан устгаснаас үүдэлтэй митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай допамин мэдрэлийн эсүүдэд (S6B зураг) PCx-ийн илэрхийлэл мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (31) бөгөөд энэ нь ацетон хүчлийн артериосклерозыг харуулж байна. Өвчний илрэл нь бие махбод дахь OXPHOS мэдрэлийн эсийн үйл ажиллагааны алдагдалд зохицуулагддаг. Артериосклерозтой холбоотой байж болох мэдрэлийн эсүүдэд илэрхийлэгдэж болох өвөрмөц ферментүүд (32-34) нь OXPHOS дутагдалтай PN-үүдэд мэдэгдэхүйц нэмэгддэг болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй, тухайлбал пропионил-КоА карбоксилаза (PCC-A), Малонил-КоА нь пропионил-КоА-г сукцинил-КоА болгон хувиргадаг болон митохондрийн алимны фермент 3 (ME3) нь гол үүрэг нь пируватыг малатаас гаргаж авах явдал юм (Зураг 3, A ба C) (33, 35). Үүнээс гадна, бид Pdk3 ферментийн мэдэгдэхүйц өсөлтийг олж тогтоосон бөгөөд энэ нь фосфоржиж, улмаар PDH-г идэвхгүйжүүлдэг (36), харин PDH-г идэвхжүүлдэг Pdp1 фермент эсвэл PDH ферментийн цогцолборт ямар ч өөрчлөлт илрээгүй (Зураг 3A). Mern2cKO PN-үүдэд Ser293 дахь PDH цогцолборын пируват дегидрогеназа E1 бүрэлдэхүүн хэсгийн α1 дэд нэгж α (PDHE1α) дэд нэгжийн фосфоржилт (PDDH-ийн ферментийн идэвхийг дарангуйлдаг гэдгээрээ алдартай) тогтмол нэмэгдсэн (Зураг S6C) (Зураг S6C). Пируват нь судасны хандалтгүй.
Эцэст нь бид идэвхжүүлэлтийн процессын явцад серин ба глициний биосинтезийн супер зам, холбогдох митохондрийн фолатын (1C) мөчлөг ба пролин биосинтез (Зураг 1G ба Зураг S5C) нь мэдэгдэхүйц нэмэгддэг болохыг тайланд дурдсан. Эргэн тойрны эдүүд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай идэвхждэг (5-7). Эдгээр протеомикийн өгөгдлийг дэмжсэн конфокал шинжилгээгээр OXPHOS байхгүй PN-д 8 долоо хоногтой хулганы тархины зүсмэлүүдийг митохондрийн фолатын мөчлөгийн гол фермент болох серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2)-д хамруулсан болохыг харуулсан. Дархлааны хариу урвал мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг S5D). CU-глюкозоор инкубацлагдсан 13 цочмог тархины зүсмэлүүдэд бодисын солилцооны мөрдөх туршилтууд нь серин ба пролин биосинтезийн нэмэгдсэнийг баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь нүүрстөрөгчийн изоформын серин ба пролин руу урсгал нэмэгдсэнийг харуулж байна (Зураг S5E). GLS болон GPT2-ийн өдөөгдсөн урвалууд нь глутаминаас глутаматын нийлэгжилт болон глутамат ба α-кетоглютаратын хоорондох трансаминжуулалтыг хариуцдаг тул тэдгээрийн өсөлт нь OXPHOS дутагдалтай мэдрэлийн эсүүд глутаматын хэрэгцээ нэмэгдэж байгааг харуулж байна. Энэ нь пролины биосинтезийг нэмэгдүүлэх зорилготой байж болох юм (Зураг S5C). Эдгээр өөрчлөлтүүдээс ялгаатай нь PN-тэй холбоотой Mfn2cKO хулгануудын тархины тархины астроцитын протеомын шинжилгээгээр эдгээр замууд (бүх антипероксидазуудыг оруулаад) илэрхийлэлд мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөөгүй болохыг харуулсан бөгөөд ингэснээр энэхүү бодисын солилцооны дахин чиглүүлэлт нь задралд орсон PN-д сонгомол болохыг харуулж байна (Зураг S6, D-ээс G хүртэл).
Товчхондоо, эдгээр шинжилгээгээр PN-д тодорхой бодисын солилцооны замуудын түр зуурын идэвхжлийн мэдэгдэхүйц өөр хэв маягийг илрүүлсэн. Мэдрэлийн эсийн митохондрийн хэвийн бус үйл ажиллагаа нь атеросклерозын эхэн үе болон 1C өөрчлөлтөд (Зураг 3E ба Зураг S5C), тэр ч байтугай I ба IV цогцолборын илэрхийлэлд урьдчилан таамаглах боломжтой өөрчлөлтүүдэд хүргэдэг ч серин де ново синтезийн өөрчлөлт нь зөвхөн хожуу үе шатанд л илэрсэн. OXPHOS үйл ажиллагааны алдагдал (Зураг 3E ба Зураг S5C). Эдгээр олдворууд нь стрессээс үүдэлтэй митохондрийн (1C мөчлөг) болон цитоплазмын (серины биосинтез) хариу үйлдэл нь TCA мөчлөгт атеросклерозын өсөлттэй синергетик байдлаар мэдрэлийн эсийн солилцоог өөрчлөх дараалсан үйл явцыг тодорхойлдог.
8 долоо хоногийн настай OXPHOS дутагдалтай PN нь өндөр давтамжийн өдөөлтийн идэвхийг хадгалж, митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдлыг нөхөхийн тулд бодисын солилцооны мэдэгдэхүйц дахин холболтыг хийж чаддаг. Энэхүү нээлт нь энэ мөчид ч гэсэн эдгээр эсүүд мэдрэлийн эсийн доройтлыг хойшлуулах эсвэл урьдчилан сэргийлэх эмчилгээний арга хэмжээ авах боломжтой гэсэн сонирхолтой боломжийг бий болгож байна. Хожуу. Бид энэ боломжийг хоёр бие даасан арга замаар шийдсэн. Эхний аргаар бид Cre-хамааралтай адено-холбоотой вирус (AAV) векторыг бүтээсэн бөгөөд ингэснээр MFN2 нь in vivo OXPHOS дутагдалтай PN-д сонгомол байдлаар илэрхийлэгдэх боломжтой болсон (Зураг S7A). MFN2-г кодчилдог AAV болон флуоресцент репортер ген mCherry (Mfn2-AAV)-ийг in vitro анхдагч мэдрэлийн эсийн өсгөвөрт баталгаажуулсан бөгөөд энэ нь MFN2-ийг Cre-хамааралтай байдлаар илэрхийлэхэд хүргэж, митохондрийн морфологийг аварч, улмаар Mfn2cKO мэдрэлийн эсүүдэд мэдрэлийн мутаци үүсэхээс сэргийлсэн (Зураг S7, B, D ба E). Дараа нь бид 8 долоо хоногтой Mfn2-AAV-г Mfn2cKO болон хяналтын хулгануудын тархины бор гадарт стереотактик байдлаар хүргэх in vivo туршилтуудыг хийж, 12 долоо хоногтой хулгануудыг шинжилсэн (Зураг 4A). Эмчилгээ хийлгэсэн Mfn2cKO хулганууд үхсэн (Зураг 1, A ба B) (16). Вирусын трансдукц in vivo нь зарим тархины тойрогт PN-ийн сонгомол илэрхийлэлийг бий болгосон (Зураг S7, G ба H). Зөвхөн mCherry (Ctrl-AAV) илэрхийлдэг хяналтын AAV-ийг тарьсан нь Mfn2cKO амьтдын мэдрэлийн эсийн доройтлын түвшинд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлээгүй. Үүний эсрэгээр, Mfn2-AAV-аар трансдукцлагдсан Mfn2cKO-ийн шинжилгээгээр PN эсийн давхаргын хамгаалалтын мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлсэн (Зураг 4, B ба C). Ялангуяа мэдрэлийн эсийн нягтрал нь хяналтын амьтдаас бараг ялгагдахгүй юм шиг байна (Зураг 4, B ба C, Зураг S7, H ба I). MFN2 биш харин MFN1-ийн илэрхийлэл нь мэдрэлийн эсийн үхлийг аврахад адилхан үр дүнтэй байдаг (Зураг 4C ба Зураг S7, C ба F), энэ нь эктопик MFN1-ийн илэрхийлэл нь MFN2-ийн дутагдлыг үр дүнтэй нөхөж чадна гэдгийг харуулж байна. Ганц PN түвшинд хийсэн цаашдын шинжилгээгээр Mfn2-AAV нь митохондрийн хэт бүтцийг ихээхэн аварч, mtDNA-ийн түвшинг хэвийн болгож, ангиогенезийн эсрэг маркер PCx-ийн өндөр илэрхийлэлийг буцаасан болохыг харуулсан (Зураг 4, C-ээс E хүртэл). Аврагдсан Mfn2cKO хулгануудыг тайван байдалд нь харааны үзлэгээр харахад тэдний байрлал болон хөдөлгөөний шинж тэмдгүүд (S1-ээс S3 хүртэлх хөдөлгөөн) сайжирсан байна. Эцэст нь хэлэхэд, эдгээр туршилтууд нь OXPHOS-ийн хүнд дутагдалтай PN-д MFN2-ийг хойшлуулж дахин оруулах нь mtDNA хэрэглээг буцаах, атеросклерозыг өдөөхөд хангалттай бөгөөд ингэснээр аксон доройтол болон мэдрэлийн эсийн үхлийг in vivo урьдчилан сэргийлэхэд хангалттай болохыг харуулж байна.
(A) Заасан бодисын солилцооны зам идэвхжсэн үед MFN2 кодчилдог AAV тарилгын туршилтын хуваарийг харуулсан схем. (B) Mfn2cKO хулганад 8 долоо хоногт дамжуулж, Кальбиндины эсрэгбиеээр тэмдэглэсэн 12 долоо хоногтой тархины зүсмэлүүдийн төлөөллийн конфокал зургууд. Баруун талд: Аксон ширхэгийн масштаб. Аксон томруулалтын масштаб нь 450 ба 75 μм байна. (C) Зүүн талд: AAV дамжуулалтын гогцоонд (AAV+) Пуркинье эсийн нягтралыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (дисперсийн нэг талын шинжилгээ; n = 3 хулгана). Баруун талд: 12 дахь долоо хоногт дамжуулсан PN-д mtDNA фокусын шинжилгээ (хослоогүй t-тест; гурван хулганаас n = 6 эс). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Заасан вирусын вектороор дамжуулсан Mfn2cKO тархины зүсмэлүүдийн PN-үүдийн төлөөллийн дамжуулалтын электрон микрографууд. Ягаан маск нь дендритүүдийн эзэлж буй хэсгийг, шар цэгтэй дөрвөлжин нь баруун талд өгөгдсөн томруулалтыг харуулж байна; n нь цөмийг илэрхийлнэ. Хуваарийн шугам, 1μm. (E) нь 12 долоо хоногт дамжуулсан PN-д PCx будгийн жишээг харуулж байна. Хуваарийн шугам, 20μm. OE, хэт илэрхийлэл; FC, нугалалтын өөрчлөлт.
Эцэст нь бид OXPHOS үйл ажиллагааны алдагдалтай PN-д пероксидазаар өдөөгдсөн эсийн амьдрах чадварын ач холбогдлыг судалсан. Бид хулганы PCx mRNA (AAV-shPCx)-ийг тусгайлан чиглүүлсэн AAV-shRNA (богино үсний хавчаартай РНХ)-ийг кодчилдог mCherry-г үүсгэн, вирус эсвэл түүний холилдсон хяналтын (AAV-scr) хулгануудын Mfn2cKO хулгануудын бага тархинд тарьсан. PCx-ийн илэрхийлэл нэмэгдэж (Зураг 3C), PN эсийн давхарга бүрэн бүтэн хэвээр байсан үед PCx-ийг үр дүнтэй нокдаун хийх зорилгоор тарилгыг дөрөв дэх долоо хоногт хийсэн (Зураг 5A). PCx-ийг нокдаун хийх нь (Зураг S8A) нь PN-ийн үхлийг мэдэгдэхүйц хурдасгахад хүргэдэг бөгөөд энэ нь халдвар авсан цагирагт хязгаарлагддаг (Зураг 5, B ба C). PCx-ийн өсөлтийн зохицуулалтаас үүдэлтэй бодисын солилцооны нөлөөллийн механизмыг ойлгохын тулд бид PCx-ийн нокаут болон AAV-зуучлалтай оптик биосенсор Grx1-roGFP2-ийг нэгэн зэрэг илэрхийлсний дараа PN-ийн исэлдэлтийн төлөвийг судалсан (Зураг S8, B-D), глутатионыг үнэлэх зорилгоор (38). Дараа нь бид FLIM нөхцлийг баталгаажуулсны дараа цитоплазмын исэлдэлтийн төлөвийн болзошгүй өөрчлөлтийг илрүүлэхийн тулд 7 долоо хоногтой Mfn2cKO эсвэл хяналтын хог хаягдлын цочмог тархины зүсмэлүүдэд хоёр фотоны флуоресценцийн насан туршийн дүрслэлийн микроскоп (FLIM) хийсэн (Зураг S8, E-G). Шинжилгээгээр PCx экспрессгүй ганц Mfn2cKO PN-ийн исэлдэлтийн төлөв мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн нь хяналтын мэдрэлийн эсүүд эсвэл зөвхөн холилдсон shRNA илэрхийлдэг Mfn2cKO PN-үүдээс ялгаатай (Зураг 5, D ба E). PCx экспрессийг бууруулж зохицуулахад өндөр исэлдсэн төлөвтэй Mfn2cKO PN-ийн хувь гурваас дээш дахин нэмэгдсэн (Зураг 5E), энэ нь PCx-ийн зохицуулалт нэмэгдэх нь доройтсон мэдрэлийн эсүүдийн исэлдэн ангижрах чадварыг хадгалж байгааг харуулж байна.
(A) Заасан бодисын солилцооны зам идэвхжсэн үед shPCx кодчилдог AAV тарилгын туршилтын хуваарийг харуулсан схем. (B) 4 долоо хоногт кальциневрины эсрэгбиеээр дамжуулж, шошгологдсон Mfn2cKO хулгануудын 8 долоо хоногтой тархины хэсгүүдийн төлөөллийн конфокал гэрэл зураг. Хуваарийн баар, 450μm. (C) AAV дамжуулсан гогцоонд Пуркинье эсийн нягтралыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (дисперсийн нэг талын шинжилгээ; n = 3-4 хулгана). Өгөгдлийг дундаж ± SEM гэж илэрхийлнэ; ***P<0.001. (D) Төлөөллийн FLIM зураг нь тодорхой туршилтын нөхцөлд глутатион исэлдэн ангижрах мэдрэгч Grx1-roGFP2 илэрхийлдэг 7 долоо хоногтой PN-ийн дундаж наслалтыг харуулж байна. LUT (хайх хүснэгт) харьцаа: амьдрах хугацааны интервал (пикосекундээр). Хуваарийн баар, 25μm. (E) Гистограмм нь (D)-ээс Grx1-roGFP2 амьдралын хугацааны утгуудын тархалтыг харуулж байна (нөхцөл бүрийн нөхцөлд хоёр хулганад n=158-аас 368 эс хүртэл). Гистограмм бүрийн дээрх дугуй диаграмм: CTRL-AAV-scr дахь дундаж амьдралын хугацааны утгын 1 SD-ээс давсан, мэдэгдэхүйц урт (улаан, исэлдсэн) эсвэл богино (цэнхэр, багассан) амьдралын хугацаатай эсүүдийн тоог харуулж байна. (F) Санал болгож буй загвар нь мэдрэлийн эсийн PCx-ийн өсөлтийн хамгаалалтын үр нөлөөг харуулж байна.
Ерөнхийдөө бидний энд өгсөн өгөгдлүүд нь MFN2-ийн дахин илэрхийлэл нь хүнд хэлбэрийн OXPHOS дутагдал, хүнд хэлбэрийн mtDNA хомсдол, маш хэвийн бус ista төст морфологитой хүнд хэлбэрийн PN-ийг бүрэн аварч, улмаар хүнд хэлбэрийн өвчний үед ч тасралтгүй ахиц дэвшил гаргах боломжтойг харуулж байна. Мэдрэлийн доройтол нь эсийн үхлийн өмнөх үе шатыг буцаах боломжтой нотолгоог өгдөг. Бодисын солилцооны уян хатан байдлын энэ түвшинг мэдрэлийн эсүүд атеросклерозыг (TCA мөчлөгийн дахин холболт) өдөөх чадвараар улам бүр онцолж байгаа бөгөөд энэ нь OXPHOS дутагдалтай PN-д PCx илэрхийлэлийг дарангуйлж, эсийн үхлийг сайжруулж, улмаар хамгаалалтын үүрэг гүйцэтгэдэг (Зураг 5F).
Энэхүү судалгаанд бид OXPHOS үйл ажиллагааны алдагдалд PN-ийн хариу үйлдэл нь бодисын солилцооны хөтөлбөрөөр идэвхжүүлсэн дифференциал идэвхжүүлэлтийн замаар аажмаар TCA мөчлөгийн атеросклероз руу шилжих явдал болохыг нотолсон. Бид протеомик шинжилгээг олон нэмэлт аргуудаар баталгаажуулж, митохондрийн хүнд хэлбэрийн үйл ажиллагааны алдагдалд өртөх үед мэдрэлийн эсүүд өмнө нь мэдэгдэж байгаагүй бодисын солилцооны уян хатан чанартай байдаг болохыг тогтоосон. Бидний гайхшралыг төрүүлэм зүйл бол бүхэл бүтэн дахин холбох үйл явц нь мэдрэлийн эсийн доройтол аажмаар, эргэлт буцалтгүй дагалддаг эцсийн бодисын солилцооны төлөвийг заавал тэмдэглэдэггүй боловч бидний өгөгдөл нь эсийн үхлийн өмнөх үе шатанд ч гэсэн хадгалах мэдрэлийн эсийг бүрдүүлж болохыг харуулж байна. Функциональ нөхөн олговрын механизм. Энэхүү олдвор нь мэдрэлийн эсүүд бие махбодид бодисын солилцооны уян хатан чанарыг мэдэгдэхүйц хэмжээгээр агуулдаг болохыг харуулж байна. Энэ баримт нь MFN2-ийг хожим дахин нэвтрүүлэх нь бодисын солилцооны гол маркеруудын илэрхийлэлийг эргүүлж, PN-ийн доройтлоос урьдчилан сэргийлэх боломжтой гэдгийг нотолж байна. Харин ч эсрэгээрээ энэ нь атеросклерозыг дарангуйлж, мэдрэлийг хурдасгадаг. транссексуал.
Бидний судалгааны хамгийн сонирхолтой олдворуудын нэг бол OXPHOS дутагдалтай PN нь артериосклерозыг өдөөдөг ферментүүдийг нэмэгдүүлснээр TCA мөчлөгийн бодисын солилцоог өөрчилж чаддаг явдал юм. Бодисын солилцооны дахин зохион байгуулалт нь хорт хавдрын эсүүдийн нийтлэг шинж чанар бөгөөд зарим нь амьсгалын гинжин хэлхээг хөдөлгөж, липид ба нуклеотидын биосинтезийн урьдал бодисын үйлдвэрлэлийг хадгалдаг бууруулах эквивалентуудыг үйлдвэрлэхийн тулд TCA мөчлөгийн завсрын бүтээгдэхүүнийг нөхөхийн тулд глутаминаас хамаардаг (39, 40). Саяхны нэгэн судалгаагаар OXPHOS-ийн үйл ажиллагааны алдагдалтай захын эдэд глутамин/глутаматын солилцооны дахин холболт нь бас нэг онцлог шинж чанартай болохыг харуулсан (5, 41), энд глутаминыг TCA мөчлөгт оруулах чиглэл нь OXPHOS гэмтлийн хүнд байдлаас хамаарна (41). Гэсэн хэдий ч бие махбод дахь мэдрэлийн эсийн бодисын солилцооны уян хатан чанар болон өвчний нөхцөлд түүний хамаарлын талаар тодорхой нотолгоо байхгүй байна. Саяхны in vitro судалгаагаар анхдагч кортикал мэдрэлийн эсүүд нь мэдрэлийн дамжуулалтад глутаматын санг дайчилж, улмаар бодисын солилцооны стрессийн нөхцөлд исэлдэлтийн солилцоо болон атеросклерозыг дэмждэг болохыг харуулсан (42). TCA мөчлөгийн фермент сукцинатдегидрогеназын фармакологийн дарангуйллын дор пируватын карбоксилизаци нь өсгөвөрлөсөн тархины мөхлөгт мэдрэлийн эсүүдэд оксалоацетатын нийлэгжилтийг хадгалдаг гэж үздэг болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй (34). Гэсэн хэдий ч эдгээр механизмын тархины эдэд физиологийн ач холбогдол (атеросклероз нь голчлон астроцитоор хязгаарлагддаг гэж үздэг) нь физиологийн чухал ач холбогдолтой хэвээр байна (43). Энэ тохиолдолд бидний өгөгдөл нь бие махбодид OXPHOS-оор гэмтсэн PN-үүд нь TCA сангийн завсрын бүтээгдэхүүнийг нэмэлт тэжээлийн хоёр үндсэн эх үүсвэр болох BCAA задрал ба пируватын карбоксилизацид шилжиж болохыг харуулж байна. BCAA катаболизм нь мэдрэлийн эсийн энергийн солилцоонд оруулсан хувь нэмрийг санал болгосон боловч глутамат ба GABA-ийн мэдрэлийн дамжуулалтад гүйцэтгэх үүргээс гадна (44) эдгээр механизмын талаар in vivo нотолгоо байхгүй хэвээр байна. Тиймээс үйл ажиллагааны алдагдалтай PN-үүд нь атеросклерозыг нэмэгдүүлэх замаар шингээлтийн процессоор өдөөгдсөн TCA завсрын бүтээгдэхүүний хэрэглээг автоматаар нөхөж чадна гэж таамаглахад хялбар байдаг. Ялангуяа митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай эсүүдийн үржиж буй үед аспартын хүчлийн хэрэгцээг нэмэгдүүлэхийн тулд PCx-ийн зохицуулалтыг нэмэгдүүлэх шаардлагатай байж болох юм (45). Гэсэн хэдий ч бидний метаболомик шинжилгээгээр Mfn2cKO PN-үүд дэх аспартын хүчлийн тогтвортой төлөвийн түвшинд мэдэгдэхүйц өөрчлөлт гараагүй (Зураг S6A), энэ нь үржиж буй эсүүд болон митозын дараах мэдрэлийн эсүүдийн хооронд аспартын хүчлийн бодисын солилцооны хэрэглээний ялгаатай байдлыг тусгасан байж магадгүй юм. In vivo үйл ажиллагааны алдагдалтай мэдрэлийн эсүүдэд PCx-ийн зохицуулалтын яг механизмыг тодорхойлох шаардлагатай хэвээр байгаа ч энэхүү дутуу хариу үйлдэл нь мэдрэлийн эсүүдийн исэлдэн ангижрах төлөвийг хадгалахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг бид харуулсан бөгөөд үүнийг тархины зүсмэлүүд дээр хийсэн FLIM туршилтаар харуулсан. Ялангуяа PN-үүд PCx-ийг нэмэгдүүлэхээс урьдчилан сэргийлэх нь илүү исэлдсэн төлөвт хүргэж, эсийн үхлийг хурдасгадаг. BCAA задралыг идэвхжүүлэх болон пируватын карбоксилжилт нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай захын эдийг тодорхойлох арга биш юм (7). Тиймээс эдгээр нь OXPHOS дутагдалтай мэдрэлийн эсүүдийн тэргүүлэх шинж чанар бөгөөд цорын ганц шинж чанар биш ч гэсэн мэдрэлийн эсийн доройтолд чухал ач холбогдолтой юм шиг санагддаг.
Тархины бага тархины өвчин нь ихэвчлэн атакси хэлбэрээр илэрдэг бөгөөд ихэвчлэн PN-ийг гэмтээдэг мэдрэлийн эсийн доройтлын олон янзын өвчин юм (46). Энэ мэдрэлийн эсийн популяци нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд онцгой өртөмтгий байдаг, учир нь хулганад сонгомол доройтол нь хүний ​​нурууны тархины атаксиг тодорхойлдог олон хөдөлгөөний шинж тэмдгийг хуулбарлахад хангалттай байдаг (16, 47, 48). Мэдээллийн дагуу мутант гентэй трансген хулганы загвар нь хүний ​​нурууны тархины атакситай холбоотой бөгөөд митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалтай байдаг (49, 50), энэ нь PNPH-д OXPHOS дутагдлын үр дагаврыг судлахын ач холбогдлыг онцолж байна. Тиймээс энэхүү өвөрмөц мэдрэлийн эсийн популяцийг үр дүнтэй тусгаарлаж, судлах нь онцгой тохиромжтой юм. Гэсэн хэдий ч PN нь даралтад маш мэдрэмтгий бөгөөд тархины нийт эсийн популяцийн бага хувийг эзэлдэг тул олон омикс дээр суурилсан судалгааны хувьд тэдгээрийг бүхэл эс болгон сонгон ялгах нь бэрхшээлтэй хэвээр байна. Бусад эсийн төрлүүдийн (ялангуяа насанд хүрэгчдийн эд эсийн) бохирдлыг бүрэн арилгах нь бараг боломжгүй боловч бид протеомикийн шинжилгээнд хангалттай тооны амьдрах чадвартай мэдрэлийн эсүүдийг авахын тулд FACS-тай үр дүнтэй диссоциацийн алхамыг хослуулсан бөгөөд бүхэл бүтэн бага тархины одоо байгаа өгөгдлийн багцтай харьцуулахад нэлээд өндөр уургийн бүрхүүлтэй (ойролцоогоор 3000 уураг) болсон (51). Бүхэл эсийн амьдрах чадварыг хадгалснаар бидний энд өгсөн арга нь митохондрийн бодисын солилцооны замын өөрчлөлтийг шалгахаас гадна түүний цитоплазмын эсрэг талын өөрчлөлтийг шалгах боломжийг олгодог бөгөөд энэ нь эсийн төрлийг баяжуулахын тулд митохондрийн мембраны шошгыг ашиглахыг нөхдөг. Нарийн төвөгтэй эд дэх митохондрийн тооны шинэ арга (52, 53). Бидний тайлбарласан арга нь зөвхөн Пуркинье эсийн судалгаатай холбоотой төдийгүй митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалын бусад загваруудыг оролцуулан өвчтэй тархинд бодисын солилцооны өөрчлөлтийг шийдвэрлэхийн тулд аливаа төрлийн эсэд хялбархан хэрэглэж болно.
Эцэст нь бид энэхүү бодисын солилцооны өөрчлөлтийн үйл явцын үед эсийн стрессийн гол шинж тэмдгүүдийг бүрэн эргүүлж, мэдрэлийн эсийн доройтлоос урьдчилан сэргийлэх боломжтой эмчилгээний цонхыг тодорхойлсон. Тиймээс энд тайлбарласан дахин холболтын үйл ажиллагааны үр нөлөөг ойлгох нь митохондрийн үйл ажиллагааны алдагдалд мэдрэлийн эсийн амьдрах чадварыг хадгалах боломжит эмчилгээний талаар үндсэн ойлголт өгөх болно. Энэхүү зарчмыг бусад мэдрэлийн өвчинд бүрэн хэрэгжүүлэхийн тулд тархины бусад эсийн төрлүүдийн энергийн солилцооны өөрчлөлтийг задлан шинжлэхэд чиглэсэн ирээдүйн судалгаа шаардлагатай байна.
MitoPark хулгануудыг өмнө нь тайлбарласан (31). loxP хажуу талын Mfn2 гентэй C57BL/6N хулгануудыг өмнө нь тайлбарласан (18) бөгөөд L7-Cre хулгануудтай эрлийзжүүлсэн (23). Үүссэн давхар гетерозигот үр төлийг дараа нь гомозигот Mfn2loxP/Mfn2loxP хулгануудтай эрлийзжүүлж, Mfn2-ийн Пуркинье өвөрмөц генийн нокаутыг (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) үүсгэсэн. Хослолын дэд хэсэгт Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллель (stop-mtYFP)-ийг нэмэлт эрлийзжүүлэлтээр нэвтрүүлсэн (20). Амьтны бүх процедурыг Европын, үндэсний болон байгууллагын удирдамжийн дагуу гүйцэтгэж, Германы Хойд Рейн-Вестфалийн Умвельт, Вербраухершутцын LandesamtfürNatur-аар батлагдсан. Амьтны ажлыг мөн Европын Лабораторийн Амьтны Шинжлэх Ухааны Холбооны удирдамжийн дагуу хийдэг.
Жирэмсэн эмэгтэйн умайн хүзүүний мултрал мэдээ алдуулалт хийсний дараа хулганы үр хөврөлийг ялгаж авна (E13). Тархины гадаргууг 10 мМ Хепсээр баяжуулсан Ханксийн тэнцвэржүүлсэн давсны уусмалд (HBSS) задалж, папаин (20 U/мл) болон цистеин (1μг/мл) агуулсан Дулбеккогийн Өөрчлөгдсөн Ийглийн тэжээлт орчинд дамжуулна. Эдийг DMEM-д инкубацилж, ферментийн аргаар задална. Ml) 37°C-д 20 минут байлгаад, дараа нь 10% ургийн үхрийн ийлдэсээр баяжуулсан DMEM-д механик аргаар тээрэмдэнэ. Эсийг 6 см өсгөврийн аяганд 2×106 нягтралтай эсвэл дүрслэлийн шинжилгээнд зориулж 0.5×105 эс/см2 нягтралтайгаар полилизинээр бүрсэн шилэн бүрхүүл дээр үржүүлнэ. 4 цагийн дараа тэжээлт орчинг 1% B27 нэмэлт болон 0.5 мМ ГлутаМакс агуулсан Нейробазаль ийлдэсгүй тэжээлт орчингоор сольсон. Дараа нь мэдрэлийн эсүүдийг туршилтын туршид 37°C болон 5% CO2-т байлгаж, долоо хоногт нэг удаа хооллосон. In vitro нөхцөлд рекомбинацийг өдөөхийн тулд in vitro нөхцөлд хоёр дахь өдөр мэдрэлийн эсүүдийг эмчлэхэд дараах AAV9 вирусын векторын 3μl (24 нүхтэй өсгөврийн таваг) эсвэл 0.5μl (24 нүхтэй таваг)-ийг ашигласан: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталогийн дугаар 105530-AAV9) болон AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталогийн дугаар 105545-AAV9).
Хулганы Mfn1 ба Mfn2 комплементар ДНХ (тус тус Addgene плазмид #23212 ба #23213-аас авсан)-ийг C-төгсгөлд V5 дарааллаар (GKPIPNPLLGLDST) тэмдэглэсэн бөгөөд T2A дарааллаар дамжуулан mCherry-тэй нийлдэг. Grx1-roGFP2 нь Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum)-ийн бэлэг юм. Уламжлалт клонингийн аргыг ашиглан tdTomato кассетыг сольсноор кассетыг pAAV-CAG-FLEX-tdTomato нуруунд (Addgene лавлах дугаар 28306) дэд клонинг хийж pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 болон pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторуудыг үүсгэсэн. Үүнтэй төстэй стратеги ашиглан pAAV-CAG-FLEX-mCherry хяналтын векторыг үүсгэсэн. AAV-shPCx бүтцийг үүсгэхийн тулд плазмид AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) шаардлагатай бөгөөд энэ нь хулганы PCx-ийг чиглүүлсэн shRNA-г кодчилдог ДНХ-ийн дарааллыг агуулдаг (5′CTTTCGCTCAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAG 3′). U6 промоторын хяналтан дор mCherry-г CMV промоторын хяналтан дор ашигладаг. Туслах AAV векторуудыг үйлдвэрлэх ажлыг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу гүйцэтгэсэн (Cell Biolabs). Товчхондоо, кальцийн фосфатын аргыг ашиглан mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) агуулсан дамжуулах плазмидыг ашиглан 293AAV эсүүд-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) эсвэл Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодлох генийг түр зуур трансфекц хийх, мөн AAV1 капсидын уураг болон нэмэлт уургийг кодлох. Плазмид савлах плазмидийг кальцийн фосфатын аргаар савлах. Түүхий вирусын дээд давхаргыг хуурай мөс/этанолын ваннд хөлдөөх-гэсэлтийн циклээр гаргаж авсан бөгөөд эсүүдийг фосфатын буфержуулсан давсны уусмалд (PBS) лизисжүүлсэн. AAV векторыг тасалдалгүй иодиксанол градиент хэт центрифугээр цэвэршүүлж (32,000 эрг/мин ба 4°C-д 24 цаг), Amicon хэт-15 төвөөс зугтах шүүлтүүр ашиглан баяжуулсан. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 геномын хуулбар (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX-ийн геномын титрийг өмнө нь тайлбарласны дагуу (54) бодит цагийн тоон PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) болон AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл)-ээр хэмжсэн.
Анхдагч мэдрэлийн эсүүдийг мөс шиг хүйтэн 1x PBS-д хусаж, үрлэн болгож, дараа нь фосфатаза болон протеазын дарангуйлагч (Roche) агуулсан 0.5% Triton X-100 / 0.5% натрийн дезоксихолат/PBS лизисийн буферт нэгэн төрлийн болгосон. Уургийн тоон үзүүлэлтийг бицинхонины хүчлийн шинжилгээ (Thermo Fisher Scientific) ашиглан гүйцэтгэсэн. Дараа нь уургуудыг SDS-полиакриламидын гель электрофорезоор ялгаж, дараа нь поливинилиден фторидын мембран (GE Healthcare) дээр блот хийсэн. Өвөрмөц бус хэсгүүдийг хааж, анхдагч эсрэгбиетэй (дэлгэрэнгүй мэдээллийг S1 хүснэгтээс үзнэ үү) TBST (Tween-тэй Tris-буфержуулсан давсны уусмал)-д 5% сүүнд, угаах үе шатанд болон TBST Incubate-д хоёрдогч эсрэгбиетэй хамт инкубацилна. Анхдагч эсрэгбиетэй хамт +4°C температурт шөнөжин инкубацилна. Угаасны дараа хоёрдогч эсрэгбиеийг өрөөний температурт 2 цагийн турш түрхэнэ. Дараа нь ижил блотыг β-актины эсрэгбиетэй хамт инкубацилснаар ижил ачааллыг баталгаажуулсан. Химилюминесценцийг хемилюминесценц болгон хувиргаж, хемилюминесценцийг сайжруулах замаар илрүүлэх (GE Healthcare).
Шилэн бүрхүүл дээр өмнө нь үржүүлсэн мэдрэлийн эсүүдийг заасан хугацаанд 4% параформальдегид (PFA)/PBS-ээр өрөөний температурт 10 минутын турш бэхэлсэн. Бүрхүүлийн бүрхүүлийг эхлээд өрөөний температурт 0.1% Triton X-100/PBS-ээр 5 минутын турш нэвтлээд, дараа нь хаах буферт [3% үхрийн сийвэнгийн альбумин (BSA)/PBS] оруулсан. Хоёр дахь өдөр бүрхүүлийн бүрхүүлийг хаах буфераар угааж, тохирох флуорофортой холбогдсон хоёрдогч эсрэгбиетэй хамт өрөөний температурт 2 цагийн турш инкубацалсан; эцэст нь дээжийг PBS-д 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI)-г эсрэг будгаар будаж, дараа нь Aqua-Poly/Mount ашиглан микроскопын слайд дээр бэхэлсэн.
Хулгануудыг (эрэгтэй, эмэгчин) кетамин (130 мг/кг) болон ксилазин (10 мг/кг)-ийг хэвлийн хөндийд тарьж мэдээ алдуулалт хийж, карпрофен өвдөлт намдаагч (5 мг/кг)-аар арьсан дор тарьж, бүлээн дэвсгэр бүхий стереотаксик багаж (Kopf)-д байрлуулсан. Гавлыг ил гаргаж, шүдний өрөм ашиглан бага тархины бор гадаргын хэсгийг (лямбдагаас: сүүл 1.8, хажуугийн 1, IV ба V дэлбээнүүдтэй тохирч) нимгэрүүлсэн. Муруй тариурын зүү ашиглан доорх судасжилтыг алдагдуулахгүйн тулд гавалд жижиг нүх гарган болгоомжтой хийсэн. Дараа нь нимгэн шилэн хялгасан судсыг бичил нүхэнд аажмаар (дура материйн ховдол талд -1.3-аас -1 хүртэл) оруулж, 200-300 нл AAV-г бичил тарилгачин (Наришиге) гар тариураар (Наришиге) 10-20 минутын хугацаанд бага даралттайгаар хэд хэдэн удаа тарьсан. Сэлбэ хийсний дараа вирус бүрэн тархахын тулд хялгасан судсыг дахин 10 минут байлгана. Хялгасан судсыг авсны дараа шархны үрэвслийг багасгаж, амьтан эдгэрэхийн тулд арьсыг сайтар оёдог. Мэс заслын дараа хэдэн өдрийн турш амьтдыг өвдөлт намдаах эм (каспофен)-ээр эмчилсэн бөгөөд энэ хугацаанд тэдний биеийн байдлыг сайтар хянаж, дараа нь заасан хугацаанд нь эвтанази хийсэн. Бүх процедурыг Европын, үндэсний болон байгууллагын удирдамжийн дагуу явуулсан бөгөөд Германы Хойд Рейн-Вестфалийн Умвельт ба Вербраухершутцын LandesamtfürNatur-аар батлагдсан.
Амьтдыг кетамин (100 мг/кг) болон ксилазин (10 мг/кг)-аар мэдээ алдуулалт хийж, зүрхийг эхлээд 0.1 М PBS-ээр, дараа нь PBS-д 4% PFA-аар нэвт шингэлсэн. Эдийг задлан шинжилж, 4°C-д 4% PFA/PBS-д шөнөжин бэхэлсэн. PBS-д бэхлэгдсэн тархинаас сагиттал хэсгүүдийг (50 мкм зузаантай) бэлтгэхийн тулд чичиргээт хутга (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австри) ашигласан. Өөрөөр заагаагүй бол чөлөөт хөвөгч хэсгүүдийг дээр дурдсанчлан (13) өрөөний температурт будаж, хутгасан. Товчхондоо, эхлээд олж авсан зүсмэлүүдийг 0.5% Triton X-100/PBS-ээр өрөөний температурт 15 минутын турш нэвт шингээсэн; зарим эпитопуудын (Pcx ба Shmt2) хувьд 80°C (PH 9) температурт tris-EDTA буферт энэ алхамын оронд зүсмэлүүдийг 25 минутын турш халаана. Дараа нь хэсгүүдийг анхдагч эсрэгбие (Хүснэгт S1-ийг үзнэ үү)-ээр 4°C-д хаах буферт (3% BSA/PBS) шөнөжин хутган инкубацлав. Дараагийн өдөр нь хэсгүүдийг хаах буферээр угааж, тохирох флуорофортой холбогдсон хоёрдогч эсрэгбиетэй хамт өрөөний температурт 2 цагийн турш инкубацлав; эцэст нь хэсгүүдийг PBS-д сайтар угааж, DAPI-ээр будаж, дараа нь AquaPolymount-аар микроскопын слайд дээр бэхлэв.
Дээжийг дүрслэхэд цагаан гэрлийн лазер болон 405 диодын хэт ягаан туяаны лазераар тоноглогдсон лазер сканнердах конфокал микроскоп (TCS SP8-X эсвэл TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ашигласан. Флуорофорыг өдөөж, Hybrid Detector (HyDs) ашиглан дохиог цуглуулснаар LAS-X програм хангамжийг дараалсан горимд Nyquist түүвэрлэлтэд тохирсон давхарласан зургийг цуглуулахад ашигласан: тоон бус хавтангийн хувьд энэ нь өндөр динамик дохионууд (жишээлбэл, соматик эсүүд болон дендритүүдэд) mtYFP) BrightR горимд PN-ийн тоог илрүүлэхийн тулд HyD ашиглана уу). Дэвсгэрийг багасгахын тулд 0.3-6 нс хүртэлх хаалтыг ашигладаг.
Эрэмбэлэгдсэн эсийн бодит цагийн дүрслэл. 1% B27 нэмэлт болон 0.5 мМ GlutaMax агуулсан Neurobasal-A орчинд ялгасны дараа эсийг поли-l-лизинээр бүрсэн шилэн слайд (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталогийн дугаар 80826) дээр нэн даруй үржүүлж, дараа нь эсүүд тунахын тулд 37°C температурт болон 5% CO2-т 1 цаг байлгана. Бодит цагийн дүрслэлийг цагаан лазер, HyD, 63×[1.4 тоон диафрагм (NA)] тосон объектив линз болон халаалтын үе шаттай Leica SP8 лазер сканнердах конфокал микроскоп дээр гүйцэтгэсэн.
Хулганыг нүүрстөрөгчийн давхар ислээр хурдан мэдээ алдуулалт хийж, толгойг нь тасдаж, тархийг нь гавлын яснаас хурдан гаргаж, 200μм зузаантай (13C шошголох туршилтад) эсвэл 275μм зузаантай (хоёр фотон туршилтад) сагиттал хэсэг болгон хувааж, дараах материалаар дүүргэсэн. Зайрмаг (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Герман)-ийг дараах бодисоор дүүргэсэн: 125 мМ мөстэй, нүүрстөрөгчөөр ханасан (95% O2 ба 5% CO2) бага Ca2 + хиймэл тархи нугасны шингэн (ACSF) NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкоз, 0.5 мМ CaCl2 ба 3.5 мМ MgCl2 (осмосын даралт 310-330 ммоль). Олж авсан тархины зүсмэлүүдийг өндөр агууламжтай Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоз, 1.0 мМ CaCl2 ба 2.0 мМ MgCl2) агуулсан инкубацийн өмнөх камерт шилжүүлнэ. Дунд зэргийн) рН 7.4 ба 310-320 ммоль).
Дүрслэл авах явцад зүсмэлүүдийг тусгай дүрслэлийн өрөөнд шилжүүлж, туршилтыг 32°-33°C тогтмол температурт тасралтгүй ACSF перфузийн дор гүйцэтгэсэн. Leica 25x объектив линз (NA 0.95, ус), Ti: Sapphire laser (Chameleon Vision II, Coherent)-ээр тоноглогдсон олон фотон лазер сканнердах микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems)-ийг зүсмэлийн дүрслэлд ашигласан. FLIM модуль (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2-ийн FLIM. PN-ийн цитоплазмын исэлдэлтийн төлөвийн өөрчлөлтийг сагиттал тархины зүсмэлүүдэд хоёр фотонтой FLIM-ээр хэмжсэн бөгөөд Grx1-roGFP2 биосенсор нь PN-ийг чиглүүлсэн. PN давхаргад амьдрах чадвартай PN (өөрөөр хэлбэл дендрит дагуу бөмбөлөг хэлбэртэй бүтэц эсвэл мэдрэлийн морфологийн өөрчлөлт байхгүй) болон давхар эерэг roGFP2 мэдрэгч болон shRNA PCx эсвэл түүний хяналтын дарааллыг (тус бүр mCherry-г хамт илэрхийлдэг) кодчилдог AAV байгаа эсэхийг баталгаажуулахын тулд зүсмэлийн гадаргуугаас 50-80 мкм орчим зайд олж авах талбарыг сонгоно. 2x дижитал томруулалттай [өдөөлтийн долгионы урт: 890 нм; 512 нм 512 пиксел] нэг давхар зургийг цуглуулж, муруй тохируулахад хангалттай фотон цуглуулсан (нийт 1000 фотон) эсэхийг баталгаажуулахын тулд 2-3 минутын дотор дундажласан зургийг ашиглана. Grx1-roGFP2 датчикийн мэдрэг чанар болон FLIM нөхцлийн баталгаажуулалтыг перфузийн ACSF-д экзоген 10 мМ H2O2 нэмэх үед roGFP2-ийн ашиглалтын хугацааг хянах (исэлдэлтийг хамгийн их байлгахын тулд ашиглалтын хугацааг уртасгах), дараа нь 2 мМ дитиотреитол нэмэх (буурах түвшинг хамгийн бага байлгаж, ашиглалтын хугацааг бууруулдаг) замаар гүйцэтгэсэн (Зураг S8, D-ээс G хүртэл). Олж авсан үр дүнг шинжлэхийн тулд FLIMfit 5.1.1 програм хангамжийг ашиглан бүхэл зургийн нэг экспоненциал задралын муруйг хэмжсэн IRF (багажны хариу үйлдлийн функц)-тэй тохируулж, χ2 нь ойролцоогоор 1 байна. Нэг PN-ийн ашиглалтын хугацааг тооцоолохын тулд мэдрэлийн биеийн эргэн тойрон дахь маскыг гараар зурж, маск бүрийн дундаж ашиглалтын хугацааг тоон үзүүлэлтэд ашигласан.
Митохондрийн потенциалын шинжилгээ. Цочмог хэсгийг 100 нМ TMRM-ээр перфузийн ACSF-д шууд нэмээд 30 минутын турш инкубацалсны дараа PN-ийн митохондрийн потенциалын өөрчлөлтийг хоёр фотон микроскопоор хэмжсэн. TMRM дүрслэлийг зондыг 920 нм-д өдөөж, дохио цуглуулахын тулд дотоод HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) ашиглан гүйцэтгэсэн; ижил өдөөлтийн долгионы уртыг ашиглах боловч mtYFP-г дүрслэхэд өөр дотоод HyD (FITC:525/50) ашиглан. Нэг эсийн түвшинд митохондрийн потенциалыг үнэлэхийн тулд ImageJ-ийн Зургийн тооцоолуурын залгаасыг ашиглана уу. Товчхондоо, залгуурын тэгшитгэл: дохио = мин (mtYFP, TMRM) нь харгалзах сувгийн нэг давхар конфокал дүрсэнд Пуркинже Сомали дахь TMRM дохиог харуулсан митохондрийн бүсийг тодорхойлоход ашиглагддаг. Дараа нь үүссэн маск дахь пикселийн талбайг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж, дараа нь mtYFP сувгийн харгалзах босго дан давхаргатай дүрс дээр хэвийн болгож, митохондрийн потенциалыг харуулсан митохондрийн фракцыг гаргана.
Зургийг Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) програм хангамжаар мушгирсан. Хавтангийн сканнердсан зургуудын хувьд LAS-X програм хангамжийн өгсөн автомат оёдлын алгоритмыг ашиглан нэг хавтангийн монтажийг хийдэг. Зургийн тохируулгын дараа зургийг цаашид боловсруулж, гэрэлтэлт болон ялгарлыг жигд тохируулахын тулд ImageJ болон Adobe Photoshop ашиглана уу. График бэлтгэхэд Adobe Illustrator ашиглана уу.
mtDNA фокусын шинжилгээ. mtDNA гэмтлийн тоог конфокал микроскопоор ДНХ-ийн эсрэгбиеээр тэмдэглэгдсэн тархины хэсгүүд дээр тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Бай хэсэг бүрийг эсийн бие болон эс бүрийн цөмд зориулж үүсгэсэн бөгөөд тус тусын хэсгийг Multi Measure залгаас (ImageJ програм хангамж) ашиглан тооцоолсон. Цитоплазмын хэсгийг авахын тулд эсийн биеийн хэсгээс цөмийн хэсгийг хас. Эцэст нь Analyse Particles залгаас (ImageJ програм хангамж)-ыг ашиглан босго зураг дээрх mtDNA-г зааж буй цитоплазмын ДНХ-ийн цэгүүдийг автоматаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж, олж авсан үр дүнг CTRL хулгануудын PN дундажтай хэвийн болгосон. Үр дүнг эс дэх нуклеозидын дундаж тоогоор илэрхийлнэ.
Уургийн экспрессийн шинжилгээ. ImageJ-ийн Image Calculator залгаасыг ашиглан PN-д уургийн экспрессийг нэг эсийн түвшинд үнэлнэ үү. Товчхондоо, харгалзах сувгийн нэг давхаргат конфокал дүрсэнд, дохио = мин (mtYFP, эсрэгбие) тэгшитгэлээр дамжуулан Пуркина дахь тодорхой эсрэгбиед дархлааны хариу урвал үзүүлдэг митохондрийн бүсийг тодорхойлно. Дараа нь үүссэн маск дахь пикселийн талбайг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлж, дараа нь харуулсан уургийн митохондрийн фракцийг авахын тулд mtYFP сувгийн харгалзах босго нэг давхар дүрс дээр хэвийн болгоно.
Пуркинье эсийн нягтралын шинжилгээ. ImageJ-ийн Cell Counter залгаасыг ашиглан тоолсон Пуркинье эсийн тоог тоолсон эсүүдийн эзэлж буй тархины цагирагийн уртад хувааж Пуркинье нягтралыг үнэлэв.
Дээж бэлтгэх ба цуглуулах. Хяналтын бүлэг болон Mfn2cKO хулгануудын тархийг 0.1 М фосфатын буфер (PB)-д 2% PFA/2.5% глутаральдегидэд бэхлээд, дараа нь титэм хэсгүүдийг инфузор (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) ашиглан бэлтгэсэн (зузаан нь 50-60 μм). Дараа нь PB буферт 1% os тетраоксид болон 1.5% калийн ферроцианидад өрөөний температурт 1 цаг бэхэлсэн. Хэсгүүдийг нэрмэл усаар гурван удаа угааж, дараа нь 1% уранил ацетат агуулсан 70% этанолоор 20 минутын турш будсан. Дараа нь хэсгүүдийг зэрэглэлийн спиртэнд хатааж, цахиураар бүрсэн шилэн слайдуудын хооронд Durcupan ACM (Araldite цутгах давирхай M) эпокси давирхайд (Электрон микроскопийн шинжлэх ухаан, каталогийн дугаар 14040) хийж, эцэст нь 60°C-д зууханд 48 цагийн турш полимержүүлсэн. Тархины жижиг тархины гадаргуугийн хэсгийг сонгож, 50 нм хэт нимгэн хэсгүүдийг Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) дээр хайчилж, полистирол хальсаар бүрсэн 2×1 мм-ийн зэс зүсэлтийн торон дээр сонгосон. Хэсгүүдийг 4% уранил ацетатын уусмалаар 10 минутын турш будаж, H2O-оор хэд хэдэн удаа угааж, дараа нь Рейнольдсын хар тугалганы цитратаар H2O-оор 10 минутын турш угааж, дараа нь H2O-оор хэд хэдэн удаа угаасан. Микрографийг Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) дамжуулалтын электрон микроскопоор TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 дижитал камер (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ашиглан авсан. Герман).
AAV-ээр халдварласан хулгануудын тархийг салгаж, 1 мм зузаантай сагиттал хэсэгт хувааж, бага тархийг флуоресценцийн микроскоп ашиглан AAV-ээр халдварлагдсан цагиргийг (өөрөөр хэлбэл mCherry илэрхийлж байгааг) тодорхойлсон. Зөвхөн AAV тарилга нь Пуркинье эсийн давхаргын (өөрөөр хэлбэл бараг бүхэл бүтэн давхарга) дор хаяж хоёр дараалсан бага тархины цагирагт маш өндөр дамжуулалтын үр ашгийг бий болгодог туршилтуудыг ашигладаг. AAV-ээр дамжуулсан гогцоог шөнийн турш бэхэлсний дараа микродиссекция хийж (0.1 М какаоны буферт 4% PFA болон 2.5% глутаральдегид) боловсруулсан. EPON-д оруулахын тулд бэхлэгдсэн эдийг 0.1 М натрийн какаоны буфер (Applichem)-ээр угааж, 2% OsO4 (os, Science Services; Caco)-оор 0.1 М натрийн какаоны буферт (Applichem) 4 цагийн турш инкубацлаад, дараа нь 2 цагийн турш угаасан. 0.1 М кокамидын буферээр 3 удаа давтана. Дараа нь этанолын өгсөх цувралыг ашиглан этанолын уусмал бүрийг 4°C-д 15 минутын турш инкубацилж, эдийг усгүйжүүлсэн. Эдийг пропилен исэлд шилжүүлж, EPON (Sigma-Aldrich)-д 4°C-д хонуулсан. Эдийг өрөөний температурт шинэхэн EPON-д 2 цаг байлгаад, дараа нь 62°C-д 72 цагийн турш суулгасан. Хэт нимгэн зүсмэлүүдийг хэт нимгэн зүсэхийн тулд хэт нимгэн зүсэлт (Leica Microsystems, UC6) болон алмазан хутга (Diatome, Biel, Switzerland) ашиглан 37°C-д 15 минутын турш 1.5% уранил ацетатаар будаж, 4 минутын турш хар тугалганы цитратын уусмалаар будсан. Электрон микрографуудыг Camera OneView 4K 16-бит (Gatan) болон DigitalMicrograph програм хангамж (Gatan)-аар тоноглогдсон JEM-2100 Plus дамжуулах электрон микроскоп (JEOL) ашиглан авсан. Шинжилгээний зорилгоор 5000× эсвэл 10,000× дижитал томруулалттай электрон микрографуудыг авсан.
Митохондрийн морфологийн шинжилгээ. Бүх шинжилгээний хувьд ImageJ програм хангамж ашиглан дижитал зургаар бие даасан митохондрийн хэлбэрийг гараар тоймлон харуулсан. Өөр өөр морфологийн параметрүүдийг шинжилсэн. Митохондрийн нягтралыг эс бүрийн митохондрийн нийт талбайг цитоплазмын талбайд (цитоплазмын талбай = эсийн талбай-эсийн цөмийн талбай) × 100 хувааж гаргаж авсан хувиар илэрхийлнэ. Митохондрийн бөөрөнхий байдлыг [4π∙(талбай/периметр 2)] томъёогоор тооцоолно. Митохондрийн иста морфологийг шинжилж, үндсэн хэлбэрийн дагуу нь хоёр ангилалд ("гуурсан хоолой" ба "цэврүү") хуваасан.
Аутофагосом/лизосомын тоо болон нягтралын шинжилгээ. ImageJ програм хангамжийг ашиглан дижитал зураг дээрх аутофагосом/лизосомын контурыг гараар тоймло. Аутофагосом/лизосомын талбайг эс бүрийн аутофагосом/лизосомын бүтцийн нийт талбайг цитоплазмын талбайд (цитоплазмын талбай=эсийн талбай-цөмийн талбай) × 100 хувааж тооцоолсон хувиар илэрхийлнэ. Аутофагосом/лизосомын нягтыг нийт тоог эс тус бүрийн аутофагосом/лизосомын бүтцийн тоонд (цитоплазмын талбайгаар) хувааж тооцоолно (цитоплазмын талбай = эсийн талбай-цөмийн талбай).
Цочмог зүсэлт болон дээж бэлтгэх шошгололт. Глюкозын шошгололт шаардлагатай туршилтуудын хувьд цочмог тархины зүсмэлүүдийг ханасан нүүрстөрөгч (95% O2 ба 5% CO2), өндөр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоз, 1.0 мМ CaCl2 ба 2.0 мМ MgCl2, рН 7.4 ба 310-320 мОсм хүртэл тохируулсан) агуулсан инкубацийн өмнөх камерт шилжүүлнэ. Үүнд глюкоз нь 13C6- Глюкозын орлуулалттай (Eurisotop, каталогийн дугаар CLM-1396). Пируват шошголох шаардлагатай туршилтуудын хувьд цочмог тархины зүсмэлүүдийг илүү өндөр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоз, 1.0 мМ CaCl2 руу шилжүүлж, 2.0 мМ MgCl2 нэмж, рН 7.4 ба 310-аас 320 мОсм хүртэл тохируулж), 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталогийн дугаар CLM-1082) нэмнэ. Хэсгүүдийг 37°C-д 90 минутын турш инкубацлана. Туршилтын төгсгөлд хэсгүүдийг 75 мМ аммонийн карбонат агуулсан усан уусмалаар (рН 7.4) хурдан угааж, дараа нь 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): метанол: усанд нэгэн төрлийн болгоно. Хэсгүүдийг мөсөн дээр 30 минутын турш инкубацалсны дараа дээжийг 21,000 гр-д 4°C-д 10 минутын турш центрифугээр ялгаж, тунгалаг дээд давхаргыг SpeedVac баяжуулагчид хатаасан. Үүссэн хатаасан метаболит үрлийг шинжилгээ хүртэл -80°C-д хадгалсан.
13 С-тэмдэглэгдсэн амин хүчлийн шингэн хроматографи-массын спектрометрийн шинжилгээ. Шингэн хроматографи-массын спектрометрийн (LC-MS) шинжилгээнд метаболит үрлэнг 75 мкл LC-MS зэрэглэлийн усанд (Honeywell) дахин уусгасан. 21,000 г-д 4°C-д 5 минутын турш центрифугжүүлсний дараа амин хүчлийн урсгалын шинжилгээнд 20 мкл тунгалагжуулсан дээд давхаргыг ашигласан бол үлдсэн хандыг анионы шинжилгээнд шууд ашигласан (доор үзнэ үү). Амин хүчлийн шинжилгээг өмнө нь тайлбарласан бензоил хлоридын деривативжуулалтын протоколыг ашиглан хийсэн (55, 56). Эхний алхамд 20 мкл метаболитын ханд дээр 10 мкл 100 мМ натрийн карбонат (Sigma-Aldrich) нэмж, дараа нь LC зэрэглэлийн ACN дээр 10 мкл 2% бензоил хлорид (Sigma-Aldrich) нэмсэн. Дээжийг богино хугацаанд эргүүлж, дараа нь 21,000 г-д 20°C-д 5 минутын турш центрифугээр халаана. Цэвэрлэсэн дээжийг конус хэлбэрийн шилэн оруулгатай (200 мкл эзэлхүүнтэй) 2 мл-ийн авто дээж авагчийн шилэнд хийнэ. Дээжийг Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) өндөр нарийвчлалтай нарийвчлалтай масс спектрометр (Thermo Fisher Scientific)-тэй холбогдсон Acquity iClass хэт өндөр гүйцэтгэлтэй LC систем (Waters) ашиглан шинжилнэ. Шинжилгээний зорилгоор дериватив дээжийн 2 мкл-ийг 1.8 мкм хэсгүүд агуулсан 100×1.0 мм-ийн өндөр бат бэхтэй цахиурын T3 багана (Waters)-д тарьсан. Урсгалын хурд 100 мкл/мин бөгөөд буфер систем нь А буфер (10 мМ аммонийн формат ба усан дахь 0.15% шоргоолжны хүчил) ба В буфер (ACN)-ээс бүрдэнэ. Градиент нь дараах байдалтай байна: 0 минутанд 0%B; 0%B. 0-ээс 0.1 минутын хугацаанд 0-ээс 15% B; 0.1-ээс 0.5 минутын хугацаанд 15-аас 17% B; 0.5-аас 14 минутын хугацаанд 17-оос 55%; 14-өөс 14.5 минутын хугацаанд 55-аас 70%; 18 минутын хугацаанд 14.5-аас 70-аас 100% B; 18-аас 19 минутын хугацаанд 100% B; 19-өөс 19.1 минутын хугацаанд 100-аас 0% B; 19.1-ээс 28 минутын хугацаанд 0% B (55, 56). QE-HF масс спектрометр нь m/z (масс/цэнэгийн харьцаа) массын хязгаарт 50-750 хүртэл эерэг ионжуулалтын горимд ажилладаг. Хэрэглэсэн нягтрал нь 60,000 бөгөөд олж авсан олшруулалтын хяналтын (AGC) ионы бай нь 3×106 бөгөөд хамгийн их ионы хугацаа 100 миллисекунд байна. Халаалтын электрошүршигч ионжуулалтын (ESI) эх үүсвэр нь 3.5 кВ шүрших хүчдэл, 250°C капилляр температур, 60 AU бүрхүүлийн агаарын урсгал (дурын нэгж), 20 AU туслах агаарын урсгалд ажилладаг. 250°C. S линзийг 60 AU болгож тохируулсан.
13C шошготой органик хүчлүүдийн анион хроматографи-MS шинжилгээ. Үлдсэн метаболитын тунадасыг (55μl) QE-HF масс спектрометрт (Thermo Fisher Scientific) холбогдсон Dionex ионы хроматографийн систем (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ашиглан шинжилсэн. Товчхондоо, 5μl метаболитын хандыг 1-ийн дүүргэлтийн харьцаатай түлхэх хэсэгчилсэн гогцооны горимд HPLC (2 мм×250 мм, бөөмийн хэмжээ 4μm, Thermo Fisher Scientific)-ээр тоноглогдсон Dionex IonPac AS11-HC баганад шахсан. ) Dionex IonPac AG11-HC хамгаалалтын багана (2 мм x 50 мм, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Баганын температурыг 30°C-д байлгаж, автомат дээж авагчийг 6°C болгож тохируулсан. Элюент үүсгүүрээр дамжуулан калийн гидроксидын градиент үүсгэхийн тулд ионжуулсан усаар хангагдсан калийн гидроксидын картриджийг ашиглана. Метаболитуудыг 380 мкл/мин урсгалын хурдаар дараах градиентаар ялгаж авсан: 0-3 минут, 10 мМ KOH; 3-12 минут, 10-50 мМ KOH; 12-19 минут, 50-100 мМ KOH; 19-21 минут, 100 мМ KOH; 21-21.5 минут, 100-10 мМ KOH. Баганыг 10 мМ KOH-ын дор 8.5 минутын турш дахин тэнцвэржүүлсэн.
Элюцлагдсан метаболитуудыг баганын дараа 150μl/мин изопропанол нэмэлт урсгалтай нэгтгэж, дараа нь сөрөг ионжуулалтын горимд ажилладаг өндөр нарийвчлалтай масс спектрометр рүү чиглүүлдэг. MS нь m/z 50-аас 750 хүртэлх массын хүрээг 60,000 нарийвчлалтайгаар хянаж байна. AGC-г 1×106 болгож, хамгийн их ионы хугацааг 100 мс-д хадгална. Халаасан ESI эх үүсвэрийг 3.5 кВ шүрших хүчдэлээр ажиллуулсан. Ионы эх үүсвэрийн бусад тохиргоо нь дараах байдалтай байна: капилляр температур 275°C; бүрхүүлийн хийн урсгал, 60 AU; туслах хийн урсгал, 300°C-д 20 AU, S линзийг 60 AU болгож тохируулна.
13C шошготой метаболитуудын өгөгдлийн шинжилгээ. Изотопын харьцааны өгөгдлийн шинжилгээнд TraceFinder програм хангамж (4.2 хувилбар, Thermo Fisher Scientific) ашиглана уу. Нэгдэл бүрийн ижил төстэй байдлыг найдвартай лавлах нэгдлээр баталгаажуулж, бие даан шинжилсэн. Изотопын баяжуулалтын шинжилгээ хийхийн тулд 13C изотоп (Mn) бүрийн гаргаж авсан ионы хроматограммын (XIC) талбайг [M + H]+ -аас гаргаж авсан бөгөөд энд n нь амин хүчлийг шинжлэхэд ашигладаг зорилтот нэгдлийн нүүрстөрөгчийн тоо эсвэл [MH]+ -ийг анионуудыг шинжлэхэд ашигладаг. XIC-ийн массын нарийвчлал нь саяд таван хэсгээс бага, RT-ийн нарийвчлал нь 0.05 минут байна. Баяжуулалтын шинжилгээг илрүүлсэн изотоп бүрийн харгалзах нэгдлийн бүх изотопуудын нийлбэртэй харьцуулсан харьцааг тооцоолж гүйцэтгэдэг. Эдгээр харьцааг изотоп бүрийн хувьд хувийн утга болгон өгсөн бөгөөд үр дүнг өмнө нь тайлбарласны дагуу (42) молийн хувийн баяжуулалт (MPE) гэж илэрхийлнэ.
Хөлдөөсөн мэдрэлийн эсийн үрлэн эсийг мөстэй хүйтэн 80% метанол (v/v)-д нэгэн төрлийн болгож, эргүүлж, -20°C-д 30 минут инкубацлав. Дээжийг дахин эргүүлж, +4°C-д 30 минут хутгана. Дээжийг 21,000 гр-д 4°C-д 5 минутын турш центрифугээр түлхэж, дараа нь үүссэн дээд давхаргыг цуглуулж, дараа нь шинжилгээнд зориулж SpeedVac баяжуулагч ашиглан 25°C-д хатаав. Дээр дурдсанчлан, эрэмбэлэгдсэн эсийн амин хүчлүүд дээр LC-MS шинжилгээ хийсэн. TraceFinder (4.2 хувилбар, Thermo Fisher Scientific) ашиглан нэгдэл бүрийн моноизотоп массыг ашиглан өгөгдлийн шинжилгээ хийсэн. Метаболит өгөгдлийн квантийн хэвийн байдлыг preprocessCore програм хангамжийн багц (57) ашиглан гүйцэтгэсэн.
Зүсмэл бэлтгэх. Хулганыг нүүрстөрөгчийн давхар ислээр хурдан мэдээ алдуулалт хийж, толгойг нь тасдаж, тархийг нь гавлын яснаас хурдан гаргаж, мөсөөр дүүргэсэн чичиргээт хутга (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Герман) ашиглан 300-375 мкм сагиттал хэсгүүдэд хуваасан. Хүйтэн нүүрстөрөгчийн хийжүүлэлт (95% O2 ба 5% CO2) Бага Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоз, 1.0 мМ CaCl2 ба 6.0 мМ MgCl2 рН-ийг 7.4 ба 310-330 мОсм болгон тохируулна). Олсон тархины зүсмэлүүдийг рН 7.4 ба 310-320 мОсм өндөр Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрийн фосфатын буфер, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоз, 4.0 мМ CaCl2 ба mM 3.5 MgCl2) агуулсан камерт шилжүүлнэ. Бичлэг хийхээс өмнө сэргээх боломжтой байхын тулд зүсмэлүүдийг 20-30 минут хадгална.
бичлэг хийх. Бүх бичлэгт тогтмол бичлэгийн камер болон 20 дахин усанд дүрэх объектив линз (Scientifica)-тай микроскопын үе шатыг ашигласан. Пуркинье эсүүдийг (i) биеийн хэмжээ, (ii) бага тархины анатомийн байршил, (iii) флуоресцент mtYFP репортер генийн илэрхийлэлээр тодорхойлсон. 5-11 мегом үзүүрийн эсэргүүцэлтэй нөхөөстэй пипеткийг боросиликат шилэн капилляр (GB150-10, 0.86 мм×1.5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Герман) болон хэвтээ пипетк Instruments (P-1000, Саттер), Новато, Калифорниагаар татаж гаргадаг. Бүх бичлэгийг Signal програм хангамжаар (6.0 хувилбар, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) удирддаг ELC-03XS npi нөхөөстэй хавчаар өсгөгч (npi electronic GmbH, Tam, Герман) гүйцэтгэсэн. Туршилтыг 12.5 кГц түүвэрлэлтийн хурдаар бүртгэсэн. Дохиог тус тус 1.3 ба 10 кГц таслах давтамжтай хоёр богино дамжуулалтын Бессель шүүлтүүрээр шүүдэг. Мембран болон пипеткийн багтаамжийг өсгөгч ашиглан нөхөн олговрын хэлхээгээр нөхдөг. Бүх туршилтыг Хокаво програм хангамжаар (2.8 хувилбар, Хамаматсу, Герден, Герман) удирддаг Orca-Flash 4.0 камер (Хамаматсу, Герден, Герман)-ийн удирдлага дор хийсэн.
Бүхэл эсийн ердийн тохиргоо ба шинжилгээ. Бичлэг хийхээс өмнө пипеткийг дараах бодисуудыг агуулсан дотоод уусмалаар дүүргэнэ: 4.0 мМ KCl, 2.0 мМ NaCl, 0.2 мМ EGTA, 135.0 мМ калийн глюконат, 10.0 мМ Hepes, 4.0 мМ ATP (Mg), 0.5 мМ Гуанозин трифосфат (GTP) (Na) болон 10.0 мМ креатинин фосфатыг рН 7.25 болгож тохируулсан бөгөөд осмосын даралт нь 290 мОсм (сахароз) байв. Мембраныг хагарахад 0 пА хүч хэрэглэсний дараа мембраны амрах потенциалыг хэмжсэн. Оролтын эсэргүүцлийг -40, -30, -20, ба -10 пА гипертуляржуулсан гүйдэл ашиглан хэмждэг. Хүчдэлийн хариу урвалын хэмжээг хэмжиж, Омын хуулийг ашиглан оролтын эсэргүүцлийг тооцоолно. Аяндаа үүсэх идэвхжлийг хүчдэлийн хавчаарт 5 минутын турш бичиж, sPSC-г хагас автомат таних скрипт ашиглан Igor Pro (32 7.01 хувилбар, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) дээр тодорхойлж, хэмжсэн. IV муруй болон тогтвортой төлөвийн гүйдлийг зайг өөр өөр потенциалд (-110 мВ-оос эхлэн) хавчих ба хүчдэлийг 5 мВ алхамаар нэмэгдүүлэх замаар хэмждэг. AP-ийн үйлдвэрлэлийг деполяризацийн гүйдэл ашиглан туршсан. Деполяризацийн гүйдлийн импульсийг хэрэглэж байхдаа эсийг -70 мВ-д хавчих. Бичлэгийн нэгж бүрийн алхамын хэмжээг тусад нь тохируулна уу (10-60 пА). Хамгийн өндөр AP давтамжийг үүсгэдэг импульсийн оргилуудыг гараар тоолж, хамгийн их AP давтамжийг тооцоолно. AP босгыг нэг буюу хэд хэдэн AP-ийг эхлээд өдөөдөг деполяризацийн импульсийн хоёр дахь уламжлалыг ашиглан шинжилнэ.
Цоолсон нөхөөсийг тохируулах, шинжлэх. Стандарт протоколуудыг ашиглан цоолсон нөхөөсийг бүртгэнэ. Дараах найрлагыг агуулаагүй ATP болон GTP агуулаагүй пипеткийг ашиглана: 128 мМ глюконат K, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0.1 мМ EGTA болон 2 мМ MgCl2, мөн рН 7.2 (KOH ашиглан) тохируулна. Эсийн мембраны хяналтгүй нэвчилтээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд ATP болон GTP-г эсийн доторх уусмалаас хасдаг. Нөхөөсийг цоолсон нөхөөсийг бүртгэхийн тулд амфотерицин агуулсан дотоод уусмалаар (ойролцоогоор 200-250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich) дүүргэнэ. Амфотерициныг диметил сульфоксидод уусгасан (эцсийн концентраци: 0.1-0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Ашигласан DMSO-ийн концентраци нь судлагдсан мэдрэлийн эсүүдэд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлээгүй. Цоолтуурын процессын явцад сувгийн эсэргүүцлийг (Ra) тасралтгүй хянаж, Ra болон AP-ийн далайц тогтворжсоны дараа (20-40 минут) туршилтыг эхлүүлсэн. Аяндаа үүсэх идэвхжлийг хүчдэл ба/эсвэл гүйдлийн хавчаарт 2-5 минутын турш хэмждэг. Өгөгдлийн шинжилгээг Igor Pro (хувилбар 7.05.2, WaveMetrics, АНУ), Excel (хувилбар 2010, Microsoft Corporation, Redmond, АНУ) болон GraphPad Prism (хувилбар 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) ашиглан хийсэн. Аяндаа үүсэх AP-г тодорхойлохын тулд IgorPro-ийн NeuroMatic v3.0c залгаасыг ашигласан. Өгөгдсөн босгыг ашиглан AP-г автоматаар тодорхойлж, бичлэг бүрийн хувьд тус тусад нь тохируулна. Оргил давтамжийн интервалыг ашиглан оргил давтамжийг хамгийн их агшин зуурын оргил давтамж болон дундаж оргил давтамжаар тодорхойлно.
PN тусгаарлалт. Өмнө нь нийтлэгдсэн протоколд дасан зохицож, PN-ийг хулганы бага тархинаас тодорхой үе шатанд цэвэршүүлсэн (58). Товчхондоо, бага тархийг мөстэй хүйтэн диссоциацийн орчинд [HBSS Ca2+ ба Mg2+-гүйгээр, 20 мМ глюкоз, пенициллин (50 U/мл) болон стрептомицин (0.05 мг/мл)-аар баяжуулсан] задалж, жижиглээд, дараа нь орчныг папаинд [HBSS, 1-цистеин·HCl (1 мг/мл), папаин (16 U/мл) болон дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0.1 мг/мл)-аар баяжуулсан] задалсан. 30°C-д 30 минут эмчилнэ. Эхлээд эд эсийг өндөгний салст (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) болон DNase (0.1 мг/мл) агуулсан HBSS орчинд ферментийн задралаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд өрөөний температурт угааж, дараа нь 20 мМ глюкоз агуулсан HBSS орчинд HBSS, пенициллин (50 U/мл), стрептомицин (0.05 мг/мл) болон DNase (0.1 мг/мл)-д зөөлөн нунтаглаж, дан эсийг ялгаж авна. Үүссэн эсийн суспензийг 70 мкм эсийн шүүлтүүрээр шүүж, дараа нь эсийг центрифугээр (1110 эрг/мин, 5 минут, 4°C) нунтаглаж, ялгах орчинд [HBSS, 20 мМ глюкоз, 20% ургийн үхрийн сийвэн, пенициллин (50 U/мл) болон стрептомицин (0.05 мг/мл)-ээр баяжуулсан] дахин суспензлэнэ; пропидиум иодидоор эсийн амьдрах чадварыг үнэлж, эсийн нягтралыг 1×106-аас 2×106 эс/мл хүртэл тохируулна. Урсгалын цитометрийн өмнө суспензийг 50 мкм эсийн шүүлтүүрээр шүүсэн.
Урсгалын цитометр. Эсийн ялгалтыг FACSAria III машин (BD Biosciences) болон FACSDiva програм хангамж (BD Biosciences, хувилбар 8.0.1) ашиглан 4°C-д гүйцэтгэсэн. Эсийн суспензийг 100 μм цорго ашиглан 20 psi даралтын дор ~2800 үйл явдал/сек хурдтайгаар ялгасан. Уламжлалт хаалганы шалгуур (эсийн хэмжээ, хоёр талт ялгаварлан гадуурхалт, тархалтын шинж чанар) нь PN-ийг бусад эсийн төрлөөс зөв тусгаарлахыг баталгаажуулж чадахгүй тул хаалганы стратегийг mitoYFP+ ​​​​болон хяналтын mitoYFP − хулгануудад YFP-ийн эрчим ба автофлуоресценцийг шууд харьцуулах үндсэн дээр тогтоосон. YFP нь дээжийг 488 нм лазер шугамаар цацрагаар өдөөж, дохиог 530/30 нм зурвасын дамжуулалтын шүүлтүүр ашиглан илрүүлдэг. mitoYFP+ ​​​​хулгануудад Rosa26-mitoYFP репортер генийн харьцангуй хүчийг мэдрэлийн эсийн бие ба аксоны хэлтэрхийг ялгахад ашигладаг. 7-AAD-г 561 нм шар лазераар өдөөж, үхсэн эсийг хасахын тулд 675/20 нм зурвасын шүүлтүүрээр илрүүлсэн. Астроцитыг нэгэн зэрэг салгахын тулд эсийн суспензийг ACSA-2-APC-ээр будаж, дараа нь дээжийг 640 нм лазер шугамаар цацрагаар цацруулж, дохиог илрүүлэхийн тулд 660/20 нм зурвасын шүүлтүүр ашигласан.
Цуглуулсан эсүүдийг центрифугээр нунтаглаж (1110 эрг/мин, 5 минут, 4°C), хэрэглэх хүртэл -80°C-д хадгалсан. Процедурын хэлбэлзлийг багасгахын тулд Mfn2cKO хулганууд болон тэдгээрийн гөлөгнүүдийг нэг өдөр ангилсан. FACS өгөгдлийн танилцуулга болон шинжилгээг FlowJo програм хангамж (FlowJo ХХК, Ашланд, Орегон, АНУ) ашиглан хийсэн.
Дээр дурдсанчлан (59), бодит цагийн ПГУ-г ашиглан дараа нь мтДНХ-ийн тоон үзүүлэлтийг тодорхойлохын тулд эрэмбэлэгдсэн мэдрэлийн эсүүдээс ДНХ-ийг ялгаж авсан. Шугаман чанар болон босго мэдрэмжийг анх өөр өөр тооны эсүүд дээр qPCR ажиллуулж шалгасан. Товчхондоо, 50 мМ трис-HCl (рН 8.5), 1 мМ EDTA, 0.5% Tween 20 болон протеиназа К (200 нг/мл)-аас бүрдсэн лизисийн буферт 300 PN цуглуулж, 55°C-д 120 минут инкубацлана. Протеиназа К-г бүрэн идэвхгүй болгохын тулд эсүүдийг 95°C-д 10 минутын турш инкубацлана. mt-Nd1-д зориулсан TaqMan датчик (Thermo Fisher) ашиглан мтДНХ-г 7900HT бодит цагийн ПГУ системд (Thermo Fisher Scientific) хагас тоон ПГУ-аар хэмжсэн. Шинжлэх ухаан, каталогийн дугаар Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталогийн дугаар AIVI3E8) болон 18S (Thermo Fisher Scientific, каталогийн дугаар Hs99999901_s1) генүүд.
Протеомын дээж бэлтгэх. Уусмалыг 95°C-д 10 минут халааж, хэт авиагаар лизисийн буферт [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид болон 100 мМ трис- хөлдөөсөн мэдрэлийн эсийн үрэлийг HCl-д лизис хийнэ]. Биоруптор (Диагенод) дээр 10 минут (30 секундын импульс / 30 секундын түр зогсолтын хугацаа) байлгана. Дээжийг 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)-д 1:10 харьцаатай шингэлж, 300 нг трипсин алт (Promega)-тай хольж, бүрэн шингээлт хийхийн тулд 37°C-д хонуулна. Хоёр дахь өдөр дээжийг 20,000 г-д 20 минутын турш центрифугээр түлхэнэ. Дээд давхаргыг 0.1% шоргоолжны хүчилээр шингэлж, уусмалыг өөрөө хийсэн StageTips-ээр давсгүйжүүлнэ. Дээжийг SpeedVac багажид (Eppendorf баяжуулагч дээр нэмэх нь 5305) 45°C-д хатааж, дараа нь пептидийг 0.1% шоргоолжны хүчилд суспензэлсэн. Бүх дээжийг нэг хүн нэгэн зэрэг бэлтгэсэн. Астроцитын дээжийг шинжлэхийн тулд 4 мкг давсгүйжүүлсэн пептидийг 1:20 пептид ба TMT урвалжийн харьцаатай тандем массын шошго (TMT10plex, каталогийн дугаар 90110, Thermo Fisher Scientific)-ээр шошголосон. TMT шошголохын тулд 0.8 мг TMT урвалжийг 70 мкл усгүй ACN-д дахин суспензлэж, хатаасан пептидийг 9 мкл 0.1 M TEAB (триэтиламмони бикарбонат) болгон дахин найруулж, ACN-д 7 мкл TMT урвалж нэмсэн. Концентраци нь 43.75% байв. 60 минутын турш инкубацийн дараа урвалыг 2 мкл 5% гидроксиламинаар унтраасан. Тэмдэглэгдсэн пептидүүдийг цуглуулж, хатааж, 200 мкл 0.1% шоргоолжны хүчилд (FA) дахин уусгаж, хоёр хувааж, дараа нь өөрөө хийсэн StageTips ашиглан давсгүйжүүлсэн. UltiMate 3000 хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматограф (UltiMate 3000 хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматограф) ашиглан хоёр хагасын нэгийг 130Å1.7μm C18 хэсгүүдээр дүүргэсэн 1мм x 150мм Acquity хроматографийн багана дээр фракцчилсан (Waters, каталогийн дугаар SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Пептидүүдийг 30μl/мин урсгалын хурдаар ялгаж, 1%-50% буфер B-ээс 85 минутын турш шаталсан градиенттайгаар 96 минутын турш, 50%-95% буфер B-ээс 3 минутын турш, дараа нь 95% буфер B-д 8 минут байлгана; А буфер нь 5% ACN ба 10 мМ аммонийн бикарбонат (ABC), В буфер нь 80% ACN ба 10 мМ ABC байна. 3 минут тутамд фракцуудыг цуглуулж, хоёр бүлэгт (1 + 17, 2 + 18 гэх мэт) нэгтгээд вакуум центрифугт хатаана.
LC-MS/MS шинжилгээ. Массын спектрометрийн хувьд пептидүүдийг (r119.aq дугаартай) 25 см, 75 μм дотоод диаметртэй PicoFrit аналитик багана (шинэ объектив линз, эд ангийн дугаар PF7508250) дээр 1.9 μм ReproSil-Pur 120 C18-AQ орчин (Dr. Maisch, mat), Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Герман)-аар тусгаарласан. Баганыг 50°C-д байлгасан. А ба В буферууд нь усанд 0.1% шоргоолжны хүчил, 80% ACN-д 0.1% шоргоолжны хүчил агуулдаг. Пептидүүдийг 6%-31% буфер B-ээс 65 минутын турш, 31%-50% буфер B-ээс 5 минутын турш 200 nl/min градиенттайгаар тусгаарласан. Элюцлагдсан пептидүүдийг Orbitrap Fusion масс спектрометр (Thermo Fisher Scientific) дээр шинжилсэн. Пептидийн урьдал бодисын m/z хэмжилтийг 350-1500 м/з-ийн хүрээнд 120,000 нарийвчлалтайгаар гүйцэтгэсэн. 27%-ийн хэвийн болгосон мөргөлдөөний энергийг ашиглан өндөр энергитэй C занга диссоциаци (HCD) задралын хувьд 2-6 цэнэгийн төлөвтэй хамгийн хүчтэй урьдал бодисыг сонгосон. Циклийн хугацааг 1 секунд гэж тохируулсан. Пептидийн хэлтэрхийн m/z утгыг ионы зангад хамгийн бага AGC бай болох 5×104 болон хамгийн их тарилгын хугацааг 86 мс ашиглан хэмжсэн. Хуваагдлын дараа урьдал бодисыг 45 секундын турш динамик хасах жагсаалтад оруулсан. TMT-шошготой пептидүүдийг 50 см, 75 μм Acclaim PepMap багана (Thermo Fisher Scientific, каталогийн дугаар 164942) дээр ялгаж, шилжилтийн спектрүүдийг өндөр талбайн тэгш бус долгионы хэлбэрийн ион (FAIMS) тоног төхөөрөмжөөр тоноглогдсон Orbitrap Lumos Tribrid масс спектрометр (Thermo Fisher Scientific) дээр шинжилсэн (Thermo Fisher Scientific) нь −50 ба −70 В гэсэн хоёр нөхөн олговрын хүчдэл дээр ажилладаг. Синхрончлолын урьдал нөхцөл дээр үндэслэн сонгосон MS3-ийг TMT тайлангийн ионы дохионы хэмжилтэд ашигладаг. Пептидийн ялгаралтыг EASY-nLC 1200 дээр 90% шугаман градиент элюц ашиглан, буферийн концентраци 6%-31% байсан; А буфер нь 0.1% FA, В буфер нь 0.1% FA ба 80% ACN байв. Аналитик багана нь 50°C-д ажилладаг. FAIMS нөхөн олговрын хүчдэлийн дагуу анхны файлыг хуваахын тулд FreeStyle (хувилбар 1.6, Thermo Fisher Scientific) ашиглана уу.
Уургийн тодорхойлолт ба тоон үзүүлэлт. Андромеда хайлтын системийг ашиглан анхны өгөгдлийг MaxQuant хувилбар 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) ашиглан шинжилсэн. Aequorea victoria-аас гаргаж авсан Cre рекомбиназа ба YFP дарааллаас гадна хулганы лавлагаа протеомын каноник дараалал ба изоформын дарааллыг (Proteome ID UP000000589, 2017 оны 5-р сард UniProt-оос татаж авсан) пептидийн фрагментийн спектрээс хайсан. Метионины исэлдэлт ба уургийн N-терминал ацетилжилтийг хувьсах өөрчлөлт гэж тогтоосон; цистеины карбамойл метилжилтийг тогтмол өөрчлөлт гэж тогтоосон. Хоол боловсруулах параметрүүдийг "өвөрмөц чанар" ба "трипсин/P" гэж тохируулсан. Уургийн тодорхойлолтод ашигласан пептид ба сахлын пептидийн хамгийн бага тоо нь 1; өвөрмөц пептидийн хамгийн бага тоо нь 0 байна. Пептидийн газрын зургийг тохируулах нөхцөлд уургийн тодорхойлолтын түвшин 0.01 байсан. "Хоёр дахь пептид" сонголтыг идэвхжүүлсэн. Амжилттай таних тэмдгийг өөр өөр эх файлуудын хооронд шилжүүлэхийн тулд "гүйлтийн хоорондох тохирол" сонголтыг ашиглана уу. Шошгогүй тоон үзүүлэлт (LFQ) (60)-д LFQ хамгийн бага харьцааны тоо 1-ийг ашиглана уу. LFQ эрчмийг цаг хугацааны цэг бүрт дор хаяж нэг генотипийн бүлэгт дор хаяж хоёр хүчинтэй утгын хувьд шүүж, 0.3 өргөнтэй хэвийн тархалтаас гаргаж, 1.8-аар доошлуулна. LFQ үр дүнг шинжлэхийн тулд Perseus тооцоолох платформ (https://maxquant.net/perseus/) болон R (https://r-project.org/) ашиглана уу. Дифференциал илэрхийллийн шинжилгээнд limma програм хангамжийн багцаас авсан хоёр талын дунд зэргийн t тестийг ашигласан (61). Судалгааны өгөгдлийн шинжилгээг ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally болон pheatmap ашиглан гүйцэтгэсэн. TMT дээр суурилсан протеомик өгөгдлийг MaxQuant хувилбар 1.6.10.43 ашиглан шинжилсэн. 2018 оны 9-р сард татаж авсан UniProt-ын хүний ​​протеомикийн мэдээллийн сангаас түүхий протеомикийн өгөгдлийг хайж олоорой. Шинжилгээнд үйлдвэрлэгчийн өгсөн изотопын цэвэр байдлын залруулгын коэффициент багтсан болно. Дифференциал илэрхийллийн шинжилгээнд R дахь limma-г ашиглана уу. Анхны өгөгдөл, мэдээллийн сангийн хайлтын үр дүн, өгөгдлийн шинжилгээний ажлын урсгал болон үр дүнгүүд нь бүгд PXD019690 өгөгдлийн багц танигчтай PRIDE түншийн сангаар дамжуулан ProteomeXchange холбоонд хадгалагддаг.
Функциональ тэмдэглэгээ нь шинжилгээг баяжуулдаг. 8 долоо хоногийн өгөгдлийн багцын функциональ тэмдэглэгээний нэр томьёоны баялаг байдлыг тодорхойлохын тулд Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) хэрэгслийг ашигласан (Зураг 1). Товчхондоо, LC-MS/MS (тандем масс спектрометр) өгөгдлийн шинжилгээнээс олж авсан тоон уургийн жагсаалтыг дараах шүүлтүүрийн шалгуураар ашигладаг: Mus musculus-ийг төрөл зүйл болон дэвсгэр байдлаар сонгосон бөгөөд ангилал нь Бенжаминигийн 0.05 ба түүнээс доош баяжуулалтад тохируулсан P утгыг ач холбогдолтой гэж үздэг. Энэ графикийн хувьд тохируулсан P утга дээр үндэслэсэн кластер бүрийн эхний таван илүүдэл ангиллыг харуулав. Бенжамини, Кригер, Йекутиели нарын хоёр үе шаттай шугаман өдөөлтийн програмыг (Q = 5%) ашиглан олон t-тест ашиглан ангилал бүрт тодорхойлсон чухал нэр дэвшигчид дээр цаг хугацааны явцад уургийн экспрессийн шинжилгээг хийж, мөр бүрийг тусад нь шинжилдэг. Тогтмол SD ашиглах шаардлагагүй.
Энэхүү судалгааны үр дүнг нийтлэгдсэн мэдээллийн сантай харьцуулж, Зураг 1-т үзүүлсэн Венн диаграммыг гаргахын тулд бид тоон уургийн жагсаалтыг MitoCarta 2.0 тайлбартай (24) нэгтгэсэн. Диаграммыг гаргахын тулд Draw Venn Diagram онлайн хэрэгслийг (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ашиглана уу.
Протеомик шинжилгээнд ашигласан статистикийн процедурын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг Материал ба аргуудын харгалзах хэсгээс үзнэ үү. Бусад бүх туршилтын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг харгалзах домог дээрээс олж болно. Өөрөөр заагаагүй бол бүх өгөгдлийг дундаж ± SEM гэж илэрхийлсэн бөгөөд бүх статистикийн шинжилгээг GraphPad Prism 8.1.2 програм хангамж ашиглан хийсэн.
Энэ нийтлэлийн нэмэлт материалыг http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 хаягаар орж үзнэ үү.
Энэ бол Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ийн нөхцлийн дагуу тараасан нээлттэй хандалттай нийтлэл бөгөөд эцсийн хэрэглээ нь арилжааны ашиг олох зорилгоор биш бөгөөд анхны бүтээл зөв байх ёстой гэсэн үндэслэл бүхий аливаа хэрэгслээр ашиглах, түгээх, хуулбарлахыг зөвшөөрдөг. Лавлагаа.
Тэмдэглэл: Бид танаас зөвхөн имэйл хаягаа өгөхийг хүсэж байгаа бөгөөд ингэснээр таны хуудсанд санал болгож буй хүн та имэйлийг харахыг хүсч байгаа бөгөөд энэ нь спам биш гэдгийг мэдэх болно. Бид ямар ч имэйл хаягийг авахгүй.
Энэ асуултыг та зочин эсэхийг шалгах, мөн автоматаар спам илгээхээс урьдчилан сэргийлэхэд ашигладаг.
E. Motori, I. Атанасов, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Ларсон
Үйл ажиллагааны алдагдалтай мэдрэлийн эсүүдийн протеомик шинжилгээгээр бодисын солилцооны хөтөлбөрүүд мэдрэлийн эсийн доройтлыг зогсоохын тулд идэвхждэг болохыг тогтоожээ.
E. Motori, I. Атанасов, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Ларсон
Үйл ажиллагааны алдагдалтай мэдрэлийн эсүүдийн протеомик шинжилгээгээр бодисын солилцооны хөтөлбөрүүд мэдрэлийн эсийн доройтлыг зогсоохын тулд идэвхждэг болохыг тогтоожээ.
©2020 Америкийн шинжлэх ухааны дэвшлийн нийгэмлэг. бүх эрх хуулиар хамгаалагдсан. AAAS нь HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER хамтлагуудын түнш юм. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.