Одоогийн хаяг: OX11 0DE, Их Британи, Даймонд барилга, Харвелл шинжлэх ухаан, инновацийн парк, Диеткот, Оксфордшир, Их Британи, Даймонд Гэрлийн Эх үүсвэр ХХК, Электрон биологийн дүрслэлийн төв.
Урвалын төвийн гэрэл цуглуулах цогцолбор 1 (RC-LH1) нь нил ягаан фототрофик бактерийн гол фотосинтезийн бүрэлдэхүүн хэсэг юм. Бид Rhodopseudomonas palustris-ээс гаралтай RC-LH1 цогцолборын хоёр криоэлектрон микроскопийн бүтцийг нэвтрүүлсэн. RC-LH114-W цогцолборын 2.65-Å нягтралтай бүтэц нь RC-г тойрсон 14 дэд нэгж LH1 гогцооноос бүрдэх бөгөөд энэ нь уураг W-ээр тасалддаг бол уураг-W-гүй цогцолбор нь RC-ээр бүрэн хүрээлэгдсэн RC найрлага юм. Хаалттай 16 дэд нэгж LH1 гогцоо. Эдгээр бүтцийг харьцуулах нь RC-LH1 цогцолбор дахь хиноны динамикийн талаарх ойлголтыг өгдөг бөгөөд үүнд RC QB цэг дээр хиноныг холбох үед өмнө нь тодорхойлогдоогүй конформацийн өөрчлөлтүүд, мөн тэдгээрийг RC руу дамжуулахад тусалдаг туслах хинон холбох цэгүүдийн байршил орно. W уургийн өвөрмөц бүтэц нь LH1 гогцоог хаахаас сэргийлж, улмаар хинон/хинолон солилцоог хурдасгах суваг үүсгэдэг.
Фотосинтезийн энерги нь дэлхий дээрх бараг бүх амьдралыг тэтгэж чаддаг бөгөөд нарны биотехнологийн асар их боломжтой. Дэлхийн фотосинтезийг дэмжихийн зэрэгцээ нил ягаан фототрофик бактери нь янз бүрийн энергийн горим, бодисын солилцооны чадварыг харуулдаг. Тэд фотосинтезээс зайлсхийж, харанхуйд гетеротрофик бактери болж өсч, азот, нүүрстөрөгчийн давхар ислийг тогтоож, устөрөгч үүсгэж, үнэрт нэгдлүүдийг задалж чаддаг (1-3). Эдгээр процессуудад энерги өгөхийн тулд гэрлийг хурдан бөгөөд үр дүнтэй химийн энерги болгон хувиргах ёстой. Энэ процесс нь гэрэл барих антенны цогцолбор нь гэрлийг шингээж, баригдсан энергийг урвалын төв (RC) руу дамжуулж, улмаар цэнэгийн ялгаралтыг эхлүүлэх үед эхэлдэг (4-7). Нил ягаан фототрофик бактерийн фотосинтезийн үндсэн нэгж нь гэрэл цуглуулах цогцолбор 1 (LH1)-ээр хүрээлэгдсэн 2-р хэлбэрийн RC-ээс бүрдэж, RC-LH1 цөм цогцолборыг үүсгэдэг. LH1 нь муруй αβ гетеродимерүүдийн массиваар үүсдэг бөгөөд эдгээр нь тус бүр нь хоёр бактерийн хлорофилл (BChl) a молекул болон нэг эсвэл хоёр каротиноидтой холбогддог (8-12). Хамгийн энгийн LH1 антенн нь RC (9-13)-ийг хаалттай гогцоонд хүрээлсэн 16 эсвэл 17 αβ гетеродимерээс бүрддэг боловч бусад цөм цогцолборуудад трансмембран пептидүүд нь хүрээлэн буй LH1-ийн тасралтгүй байдлыг тасалдуулж, улмаар RC болон цитохром bc1 цогцолборын хоорондох хинол/хиноны тархалтыг дэмждэг (11, 13-15). Нил ягаан өнгийн фототрофик ургамал Rhodopseudomonas (Rps.) нь фотосинтезийг дэмждэг энерги болон электрон дамжуулалтыг ойлгож чаддаг загвар организм юм. Rps-ийн анхны талст бүтэц. Palustris RC-LH1 цогцолборын загвар нь RC бөгөөд 15 гетеродимер LH1 гогцооноор хүрээлэгдсэн бөгөөд эдгээр нь "Protein W" гэж нэрлэгддэг үл мэдэгдэх уурагаар тасалддаг (14). Protein-W-г дараа нь RPA4402 гэж тодорхойлсон бөгөөд энэ нь гурван урьдчилан таамагласан трансмембран спираль (TMH) бүхий шинж чанаргүй 10.5kDa уураг юм (16). Бид W уургийг кодчилдог rpa4402 генийг RC-L, M (pufL, pufM) болон LH1α, β (pufA, pufB) дэд нэгжүүдийг кодчилдог генүүдэд ашигладаг нэршилтэй нийцүүлэхийн тулд pufW болгон нэрлэхийг санал болгож байна. Сонирхолтой нь, W уураг нь RC-LH1-ийн зөвхөн 10%-д л байдаг бөгөөд энэ нь Rps. palustris нь хоёр өөр RC-LH1 цогцолбор үүсгэдэг болохыг харуулж байна. Энд бид хоёр цөм цогцолборын өндөр нягтралтай крио-EM (cryo-EM) бүтцийг мэдээлж байна, нэг нь W уураг ба 14 αβ гетеродимертэй, нөгөө нь W уураггүй ба хаалттай 16 гетеродимер LH1 гогцоотой. Бидний бүтэц нь Rps. palustris-ийн RC-LH1 цогцолборыг ойлгоход алхам алхмаар өөрчлөлтийг илэрхийлж байна, учир нь бид хувилбар бүрийн нэгэн төрлийн популяцийг шинжилж, пептид болон холбогдсон пигментүүд болон холбогдох липид ба хинонуудыг тодорхой зааж өгөх хангалттай нягтралтай болсон. Эдгээр бүтцийг харьцуулж үзэхэд одоогоор өөр RC-LH1 цогцолборт олдоогүй гурван TMH уураг-W нь хинон/хинолон солилцоог хурдасгахын тулд хинон суваг үүсгэдэг болохыг харуулж байна. Хэд хэдэн хадгалагдсан липид ба хинон холбох цэгүүдийг тодорхойлсон бөгөөд бид хинон ба RC-ийг хослуулсны дараа шинэ конформацийн өөрчлөлтийг илрүүлсэн бөгөөд энэ нь хүчилтөрөгчөөр баяжуулсан фототрофик организмын фотосистем II (PSII) RC-д тохиромжтой байж болох юм. Бидний олдворууд нь нил ягаан фототрофик бактерийн RC-LH1 цөм цогцолбор дахь хинон/хинолон холболт ба солилцооны кинетикийн талаар шинэ ойлголтыг өгч байна.
Rps. palustris-д олдсон хоёр цогцолборын нарийвчилсан судалгааг хөнгөвчлөхийн тулд бид RC-LH1 бүрийг биохимийн аргаар ялгаж авсан. Уургийн W-дутагдалтай цогцолборыг (цаашид ΔpufW гэх) pufW генгүй омгоос цэвэршүүлсэн (16) бөгөөд зөвхөн нэг RC-LH1 цогцолборыг гаргаж авах боломжтой. Уураг W агуулсан цогцолборыг омгоор үүсгэдэг. Энэ омгийн W уургийг C-төгсгөлд нь 10x His шошго ашиглан өөрчилдөг тул W агуулсан цогцолборыг металлыг хөдөлгөөнгүй болгох замаар ихэнх дутагдалтай W уурагтай үр дүнтэй нэгтгэж болно. Цогцолборыг үр дүнтэйгээр ялгаж авдаг (16) Аффинит хроматографи (IMAC).
Зураг 1-т үзүүлсэнчлэн, хоёр цогцолбор хоёулаа LH1 антеннаар хүрээлэгдсэн гурван дэд нэгж RC (RC-L, RC-M ба RC-H) агуулдаг. Уураг-W дутагдалтай цогцолборын 2.80-A бүтэц нь 16 αβ гетеродимерийг харуулж, RC-г бүрэн хүрээлсэн хаалттай LH1 гогцоо үүсгэдэг бөгөөд үүнийг цаашид RC-LH116 цогцолбор гэж нэрлэнэ. Уураг-W агуулсан цогцолборын 2.65Å бүтэц нь уураг-W-ээр тасалдсан 14-гетеродимер LH1-тэй бөгөөд үүнийг цаашид RC-LH114-W гэж нэрлэнэ.
(A ба B) Нэгдлийн гадаргуугийн дүрслэл. (C ба D) Саваанд илэрхийлэгдсэн холбогдсон пигментүүд. (E ба F) Цитоплазмын гадаргуугаас ажиглагдсан цогцолборууд нь хүүхэлдэйн кинонд дүрслэгдсэн пептид ба LH1 дэд нэгжүүдтэй бөгөөд уураг-W зайнаас цагийн зүүний дагуу дугаарлагдсан [Rba дугаарлалттай нийцдэг. sphaeroides complex (13)]. LH1-α-ийн хувьд уургийн дэд нэгжийн өнгө шар; LH1-β-ийн хувьд уургийн дэд нэгжийн өнгө цэнхэр; уураг-W-ийн хувьд уураг улаан; RC-H-ийн хувьд хөх; RC-L-ийн хувьд улбар шар; RC-M-ийн хувьд ягаан. Кофакторуудыг саваагаар, ногоон нь BChl ба BPh a молекулуудыг, нил ягаан нь каротиноидуудыг, шар нь UQ10 молекулуудыг илэрхийлнэ. (G ба H) RC-LH114-W комплекс (G) ба RC-LH116 комплекс (H)-ийн эквивалент бүс дэх уураг-W зайны томруулсан харагдац. Кофакторуудыг орон зайг дүүргэх хэлбэрээр, хелат хиноныг цэнхэр өнгөөр ​​харуулна. Уураг-W зайг (G) дотор цэнхэр тасархай шугамаар, хинон/хинолол нь LH116 цагираг дээр тархдаг жижиг нүхнүүдийг (H) дотор хар тасархай шугамаар тодруулсан болно.
Зураг 1 (A ба B) нь LH1αβ гетеродимерүүдийн нээлттэй эсвэл хаалттай массиваар хүрээлэгдсэн RC-ийг харуулж байгаа бөгөөд эдгээр нь тус бүр нь хоёр BChl болон нэг каротиноидтой холбогддог (Зураг 1, C ба D). Өмнөх судалгаагаар Rps нь LH1 цогцолбор болохыг харуулсан. Спирулина ксантины биосинтезийн замд эдгээр зүйлүүдэд каротиноидын холимог популяци агуулагддаг (17). Гэсэн хэдий ч спиропирроксантин нь давамгайлсан каротиноид бөгөөд түүний нягтрал нь хангалттай. Тиймээс бид спироксантиныг бүх LH1 холболтын цэгүүдэд загварчлахаар сонгосон. Альфа ба бета полипептидүүд нь богино мембраны гаднах бүстэй дан TMHs юм (Зураг 1, A, B, E, F). Хэдийгээр С-төгсгөлд 17 үлдэгдлийн нягтрал ажиглагдаагүй боловч альфа полипептид нь хоёр цогцолборт Met1-ээс Ala46 хүртэл задарсан. RC-LH116-д β полипептид нь Gly4-ээс Tyr52, RC-LH114-W-д Ser5-ээс Tyr52 болж буурсан. 3 эсвэл 4 N-төгсгөл эсвэл 13 C-төгсгөл үлдэгдлийн нягтрал ажиглагдаагүй (Зураг S1). Зэрлэг төрлийн омгоос бэлтгэсэн холимог RC-LH1 цогцолборын массын спектрометрийн шинжилгээгээр алга болсон хэсэг нь эдгээр пептидүүдийн гетерологийн хуваагдлын үр дүн болохыг харуулсан (Зураг S1 ба S2). α-Met1-ийн N-төгсгөлд үүссэн формаци мөн ажиглагдсан (f). Шинжилгээгээр α-пептид нь fMet1-ээс Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 хүртэлх үлдэгдлээс, β-пептид нь Ser2-оос Ala53 хүртэлх үлдэгдлээс бүрддэг нь бага температурын EM нягтралын зураглалтай сайн тохирч байна.
α-His29 болон β-His36-ийн зохицуулалт нь BChls-ийг нүүр тулан байрлуулдаг; αβ гетеродимер бүр хөршүүдтэйгээ нийлж RC-ийн эргэн тойронд нээлттэй гогцоо (RC-LH114-W) эсвэл хаалттай гогцоо (RC-LH116) үүсгэдэг. Экситон холбогдсон пигментийн массив (Зураг 1, C ба D). RC-LH114-W-ийн 877 нм зурвастай харьцуулахад RC-LH116-ийн 880 нм шингээлтийн улаан шилжилт нь 3 нм байна (Зураг 2A). Гэсэн хэдий ч дугуй дихроизмын спектр нь бараг ижил байна (Зураг 2B), энэ нь нээлттэй ба хаалттай гогцоонуудын хооронд тодорхой ялгаа байгаа ч BChls-ийн орон нутгийн орчин маш төстэй болохыг харуулж байна. Шингээлтийн улаан шилжилт нь хаалттай гогцоо дээрх дулааны хөдөлгөөн буурч, тогтвортой байдал нэмэгдсэний үр дүн (18, 19), хаалттай гогцооноос үүдэлтэй пигментийн холболтын өөрчлөлт (20, 21), эсвэл эдгээр хоёр нөлөөллийн хослолын үр дүн байж болно (11).
(A) Хэт ягаан/харагдах/ойрын хэт улаан туяаны шингээлтийн спектр, оргилуудыг харгалзах пигментүүдээр тэмдэглэж, 775 нм-ийн BPh оргилд хэвийн болгосон. (B) 805 нм-ийн BChl шингээлтэд хэвийн болгосон дугуй дихроизмын спектр. (C ба D) RC-LH114-W цогцолбор (C) болон RC-LH116 цогцолбор (D)-ийн цаг хугацааны хувьд тодорхойлогдсон шингээлтийн спектрээс сонгосон ΔA спектрүүд. Илүү сайн харьцуулахын тулд бүх спектрийг 0.2 ps-ийн −A-ийн ∆A хүртэл хэвийн болгосон. (E) UQ2-ийн янз бүрийн концентрацитай үед цацраг туяанд өртсөний дараах цитохром c2 исэлдэлтийн хурд (түүхий өгөгдлийг S8 зурагнаас үзнэ үү). (F) Бага, дунд эсвэл өндөр эрчимтэй гэрлийн дор (тус тус 10, 30 эсвэл 300μMm-2 s-1) ургасан эсүүдэд цэвэршүүлсэн цогцолбор дахь W ба RC-L дэд нэгжүүд болон тусгаарлагдсан мембраны харьцаа. Уургийн түвшинг SDS-полиакриламидын гель электрофорез болон иммуноферментийн шинжилгээгээр тодорхойлно уу (түүхий өгөгдлийг S9-р зурагт үзнэ үү). Цэвэршүүлсэн RC-LH114-W цогцолбортой харьцуулсан харьцааг тодорхойлно уу. Цогцолборын RC-L ба уураг-W-ийн стехиометрийн харьцаа 1:1 байна.
RC-LH114-W-ийн деформацилагдсан αβ14 гогцооны 1-р байрлал дахь BChls (Зураг 1, A, C, E) нь RC-LH116 дахь эквивалент BChls-ээс RC анхдагч донор (P)-д 6.8Å-ээр ойр байна (Зураг 1, B, D, F, мөн Зураг S3); гэсэн хэдий ч хоёр цогцолборын түр зуурын шингээлтийн кинетик нь RC-LH114-W ба RC-LH116-ийн хувьд LH1-ээс RC руу өдөөх энерги дамжуулах хугацааны тогтмолууд нь 40 ±4 ба 44±3 ps болохыг харуулж байна (Зураг 2). , C ба D, Зураг S4 ба Хүснэгт S2). RC доторх электрон дамжуулалтад мэдэгдэхүйц ялгаа байхгүй (Зураг S5 болон холбогдох нэмэлт текст). LH1 ба RC-P-ийн хоорондох энерги дамжуулах хугацааны ойролцоо хамаарал нь хоёр LH1 гогцоонд байгаа ихэнх BChl-ийн зай, өнцөг болон потенциал энерги ижил төстэй байгаатай холбоотой гэж бид үзэж байна. Хамгийн бага зайд хүрэхийн тулд LH1 энергийн хэв маягийг судлах нь оновчтой бус цэгүүдээс RC руу шууд энерги дамжуулахаас хурдан биш юм шиг байна. RC-LH114-W дахь нээлттэй гогцоотой LH1 гогцоо нь бүтцийн шинжилгээний хувьд бага температурын нөхцөлд бага зэргийн дулааны хөдөлгөөнд орж болох бөгөөд RC 1-ийн байрлал дахь βBChls-ийн пигментацийн зайнаас өрөөний температурт илүү урт αβ14 цагираг хэлбэртэй байдаг.
RC-LH116 цогцолбор нь 32 BChls болон 16 каротиноид агуулдаг бөгөөд түүний ерөнхий зохион байгуулалт нь Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 омог (PDB ID 7C9R) (12) болон ногоон замаг (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10)-аас гаргаж авсантай ижил байна. Зэрэгцүүлсний дараа αβ гетеродимерүүдийн байрлалд бага зэргийн хазайлт ажиглагдсан, ялангуяа 1-5, 15, 16 (S6 зураг). Уураг-W байгаа нь LH1-ийн бүтцэд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлдэг. Түүний гурван TMH нь богино гогцоогоор холбогдсон бөгөөд N-төгсгөл нь цогцолборын хөндийн талд, C-төгсгөл нь цитоплазмын талд байрладаг (1A ба 3 зураг, A-аас D хүртэл). Уураг-W нь ихэвчлэн гидрофобик (Зураг 3B) бөгөөд TMH2 ба TMH3 нь LH1αβ-14-тэй харилцан үйлчилж, трансмембран гадаргуу үүсгэдэг (Зураг 3, B ба E-ээс G хүртэл). Зайны хэсэг нь голчлон трансмембран бүс дэх Phe, Leu болон Val үлдэгдэлээс бүрдэнэ. Эдгээр үлдэгдэл нь гидрофобик амин хүчил болон αβ-14 пигментүүдээр давхарлагдсан байдаг. Зарим туйлын үлдэгдэл нь харилцан үйлчлэлд хувь нэмэр оруулдаг бөгөөд үүнд цогцолбор хөндийн гадаргуу дээрх W-Thr68 ба β-Trp42 хоорондын устөрөгчийн холбоо орно (Зураг 3, F ба G). Цитоплазмын гадаргуу дээр Gln34 нь αβ-14 каротиноидын кето бүлэгтэй зэргэлдээ оршдог. Үүнээс гадна, n-додецил β-d-малтозид (β-DDM) молекул нь уураг-W ба αβ-14 хоорондын зай хүртэл сунгагдсан бөгөөд түүний гидрофобик сүүл нь биед байрлаж болно. Мөн бид W уураг болон RCH-ийн C-төгсгөлийн нягтралын бүсүүд маш ойрхон боловч тодорхой харилцан үйлчлэл үүсгэх хүрээнд ороогүй болохыг анзаарсан (Зураг 1, А ба Е). Гэсэн хэдий ч эдгээр хоёр уургийн шийдэгдээгүй C-төгсгөлийн амин хүчлүүдэд харилцан үйлчлэл байж болох бөгөөд энэ нь RC-LH114-W цогцолборыг угсрах явцад уураг-W-г элсүүлэх механизмыг бий болгож болзошгүй юм.
(A) Хүүхэлдэйн киноны хэлбэрээр LH1αβ14-тэй зааг дээр харсан Protein-W нь электростатик потенциалын диаграммын хэсэгт (0.13 контурын түвшинтэй тунгалаг саарал гадаргуу) харуулсан саваа хэлбэртэй хажуугийн гинжтэй (улаан). (B) Уураг-W нь гидрофобик өнгөтэй гадаргуугаар дүрслэгдсэн. Туйлын болон цэнэгтэй хэсгүүдийг хөх өнгөөр, гидрофобик хэсгүүдийг цагаан өнгөөр, хүчтэй гидрофобик хэсгүүдийг улбар шар өнгөөр ​​дүрсэлсэн. (C ба D) Хүүхэлдэйн киноны Protein-W нь (A) (C)-тэй ижил чиглэлтэй бөгөөд 180° (D) эргэлддэг. Дарааллын байрлалаас хамааран ялгагдах үлдэгдэл нь солонгон өнгөний схемийг баримталдаг бөгөөд N-төгсгөл нь цэнхэр, C-төгсгөл нь улаан өнгөтэй байдаг. (E) (A)-тай ижил харагдацтай Protein-W бөгөөд уураг-W:LH1-ийн зааг дээрх үлдэгдэл нь хавсаргасан тэмдэг бүхий саваагаар дүрслэгдсэн байдаг. (F) Уураг-W нь хүүхэлдэйн дүрслэлд (E) болон LH1αβ14-тэй харьцангуй 90°, мөн баар дүрслэлд интерфэйсийн үлдэгдэлтэй харьцангуй эргэлддэг. Бета полипептидийн үлдэгдлийг шошголосон. Кофакторыг Зураг 1-ийн өнгөтэй тохирч буй баар, задарсан β-DDM-ийг саарал өнгөөр, хүчилтөрөгчийг улаан өнгөөр ​​харуулсан. (G) (F) дахь дүрслэлийг 180° эргүүлж, шошголосон альфа полипептидийн тод үлдэгдэлтэй байна.
Protein-W нь αβ гетеродимерийг (Зураг 1F-д 15 дахь нь) орлож, улмаар гогцоо хаагдахаас сэргийлж, эхний гурван αβ гетеродимерийг хазайлгаж байна. Эхний αβ-1 гетеродимерийн хальсны хэвийн хэмжээтэй харьцуулахад хамгийн их хазайлтын өнцөг нь 25°-29° байсан (Зураг 1, A ба E) бөгөөд энэ нь RC A хурц тод контраст-LH116-д αβ-1-ийн 2°-8° хазайлтаар үүссэн болохыг ажигласан (Зураг 1, B ба F). Хоёр ба гурав дахь гетеродимерүүд тус тус 12°-22° ба 5°-10° налуутай байна. RC-ийн стерик саад тотгорын улмаас αβ-1-ийн хазайлт нь αβ-ийн хоёр дахь хосыг агуулдаггүй (Зураг 1F-д 16 дахь αβ-тай тохирч байгаа), улмаар LH1 цагирагт тодорхой зай үүсгэдэг (Зураг 1, A ба E). Хоёр αβ гетеродимер байхгүй, дөрвөн BChl болон хоёр каротиноид алдагдсанаас болж каротиноидын аль нь ч мушгирсан αβ-1 дэд нэгжтэй холбогддоггүй бөгөөд үүний үр дүнд 13 Vegetarian болон 28 BChls каротиноид агуулсан LH114-W цагираг үүсдэг. αβ1-ээс 7 хүртэлх бүс дэх хоёр цогцолборын орон нутгийн нягтралын тооцоолол нь LH1 гогцооны үлдсэн хэсгээс бага байгаа нь RC QB талбайн зэргэлдээх LH1 дэд нэгжийн төрөлхийн уян хатан чанарыг тусгаж магадгүй юм (Зураг 4).
RC-LH114-W (A ба B) болон RC-LH116 (C ба D)-ийн зургуудыг Зураг 1-ийн (B ба D) дээрх ижил дээд/хажуугийн харагдац (A ба B) (A ба C) болон хөндийн гадаргуугаас харуулав. Өнгөт товчлууруудыг баруун талд харуулав.
1:14 стехиометрийн харьцаатай цорын ганц онцлог цөм цогцолбор нь Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димер юм (13). Гэсэн хэдий ч W болон PufX уураг нь илэрхий гомологигүй бөгөөд тус тусын LH1 бүтцэд мэдэгдэхүйц нөлөө үзүүлдэг. PufX нь Rps. palustris LH116αβ-16-тай харгалзах байрлалд RC-H дэд нэгжийн (13) цитоплазмын талтай харилцан үйлчилдэг N-төгсгөлийн цитоплазмын домэйнтэй дан TMH юм. PufX нь RC-LH1 болон цитохромын bcl цогцолборын хооронд хинон/хинолон солилцооны суваг үүсгэдэг бөгөөд бүх Rba. sphaeroides цөм цогцолборт байдаг (13). Хэдийгээр мономер-мономерын интерфейс нь Rba-д байдаг. RC-LH1-PufX димер сфероид нь RC-LH114-W дахь W уургийн холболтын байрлалд байрладаг бөгөөд PufX болон W уураг-W-ээр өдөөгдсөн зай нь тэнцүү байрлалд байна (Зураг S7A). RC-LH114-W дахь зай нь мөн W эсвэл PufX уурагтай холбоогүй пептидүүдээр үүсдэг Pseudomonas rosea LH1-ийн таамаглалын хинон сувагтай (8) зэрэгцдэг (Зураг S7B). Үүнээс гадна, Blc дахь хинон суваг нь нэг γ дэд нэгжийг (7) хассанаар үүссэн маргад ногоон LH1 нь ижил төстэй байрлалд байрладаг (Зураг S7C). Хэдийгээр өөр өөр уургуудаар зуучилдаг боловч эдгээр хинон/хинолол сувгууд RC-LH1 цогцолборт нийтлэг байрлалд гарч ирэх нь конвергент хувьслын жишээ мэт санагдаж байгаа бөгөөд энэ нь W уургийн үүсгэсэн зай нь хинон суваг болж болохыг харуулж байна.
LH114-W гогцооны завсар нь уургуудын адил уургийн нүх сүвээр хоёр домэйныг холбохын оронд RC-LH114-W цогцолборын дотоод орон зай болон их хэмжээний мембраны хооронд тасралтгүй мембраны бүс үүсгэх боломжийг олгодог (Зураг 1G). RC-LH116 цогцолбор нь хаалттай Tch. Зүү хэлбэртэй цогцолбортой төстэй (22) (Зураг 1H). Мембранаар дамжин хиноны тархалт нь нарийн уургийн сувгаар дамжин тархахаас хурдан байдаг тул нээлттэй LH114-W гогцоо нь хаалттай LH116 гогцооноос илүү хурдан RC эргэлтийг зөвшөөрдөг бөгөөд хиноны RC руу тархалт илүү хязгаарлагдмал байж болно. W уураг нь RC-ээр дамжин хиноны хувиралд нөлөөлдөг эсэхийг шалгахын тулд бид убихинон 2 (UQ2)-ийн тодорхой концентрацид (богино изопрен сүүлтэй байгалийн UQ10-ийн аналог) цитохромын исэлдэлтийн шинжилгээ хийсэн (Зураг 2E). Хелат хинон байгаа нь Михаэлисийн тогтмолыг нарийн тодорхойлоход саад учруулж байгаа ч (RC-LH114-W ба RC-LH116 нь тус тус 0.2±0.1μM ба 0.5±0.2μM-д тохиромжтой), RC-LH114-W-ийн хамгийн их хурд (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) нь RC-LH116-аас (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) 28±5% их байна.
Бид анх уураг-W нь цөм цогцолборын ойролцоогоор 10%-д байдаг гэж тооцоолсон (16); энд бага гэрэлтэй, дунд гэрэлтэй, өндөр гэрэлтэй өсөлтийн эсүүдийн эзлэх хувь тус тус 15±0.6%, 11±1% ба 0.9±0.5% байна (Зураг 2F). Массын спектрометрийн тоон харьцуулалтаар гистидин шошго нэмэх нь зэрлэг төрлийн омгуудтай харьцуулахад уураг-W-ийн харьцангуй элбэгшлийг бууруулаагүй болохыг харуулсан (P = 0.59), тиймээс эдгээр түвшин нь өөрчлөгдсөн уураг-W-ийн артефакт биш юм (Зураг S10). Гэсэн хэдий ч RC-LH1 цогцолбор дахь уураг-W-ийн энэхүү бага эзлэх хувь нь зарим RC-үүдийг хурдасгасан хурдаар эргүүлэх боломжийг олгож, улмаар RC-LH116 цогцолбор дахь хинон/хинолон солилцоог удаашруулж болзошгүй юм. Өндөр гэрэлтэй эзлэх хувь нь сүүлийн үеийн транскриптомикийн өгөгдөлтэй зөрчилдөж байгааг бид анзаарсан бөгөөд энэ нь pufW генийн экспресс хүчтэй гэрэлд нэмэгддэг болохыг харуулж байна (Зураг S11) (23). pufW транскрипци болон RC-LH1 цогцолборт уураг-W нэгдэх хоёрын ялгаа нь ойлгомжгүй бөгөөд уургийн нарийн төвөгтэй зохицуулалтыг тусгаж болно.
RC-LH114-W-д 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерол (POPG) болон 29 β-DDM молекулуудыг хуваарилж, загварчилсан бөгөөд үүнд 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG болон 12 βDDM багтсан болно. RC-LH116 (Зураг 5, А ба Б). Эдгээр хоёр бүтцэд CDL нь цогцолборын цитоплазмын талд бараг байрладаг бол POPC, POPG болон β-DDM нь ихэвчлэн люменаль талд байрладаг. RC-LH114-W цогцолборын αβ-1-ээс αβ-6 хүртэлх хэсэгт хоёр липид ба угаалгын нунтаг молекулуудыг тусгаарласан (Зураг 5А), харин RC-LH116-ийн эквивалент хэсэгт тавыг тусгаарласан (Зураг 5B). Цогцолборын нөгөө талд, голчлон CDL-д RC болон αβ-7-ээс αβ-13 хүртэл хуримтлагдсан илүү олон липидүүд илэрсэн (Зураг 5, А ба Б). Бусад бүтцийн хувьд шийдэгдсэн липидүүд болон угаалгын бодисууд нь LH1 цагирагны гадна байрладаг бөгөөд сайн шийдэгдсэн ацил гинжүүд нь LH1 дэд нэгжүүдийн хооронд үргэлжилдэг бөгөөд RC-LH114-W-д β-DDM гэж урьдчилсан байдлаар тодорхойлогддог бөгөөд β-DDM болон POPC-LH116-ийн RC A холимогт β-DDM гэж тодорхойлогддог. Манай бүтэц дэх хелатжуулагч липидүүд болон угаалгын бодисын ижил төстэй байрлал нь тэдгээр нь физиологийн хувьд хамааралтай холболтын цэгүүд болохыг харуулж байна (Зураг S12A). Tch-д эквивалент молекулуудын байрлал нь мөн сайн нягтралтай байдаг. Gentle болон Trv. 970 RC-LH1s омог (Зураг S12, B-ээс E хүртэл) (9, 12) болон липидийн толгойн бүлгийн устөрөгчийн холбооны үлдэгдэл нь дарааллын уялдаа холбоонд харьцангуй сайн хадгалалт үзүүлсэн (Зураг S13), энэ нь RC-тэй холбогддог CDL-ийг хадгалсан (24) эдгээр хэсгүүд нь RC-LH1 цогцолборт хадгалагдаж болохыг харуулж байна.
(A ба B) RC-LH114-W (A) болон RC-LH116 (B) пептидүүдийг 1-р зурагт үзүүлсэн өнгөний схемийг ашиглан хүүхэлдэйн киногоор, пигментүүдийг саваагаар дүрсэлсэн. Липидүүдийг улаанаар, угаалгын нунтагуудыг сааралаар харуулав. RC QA болон QB цэгүүдтэй холбогдсон UQ нь шар өнгөтэй, харин тусгаарлагдсан UQ нь цэнхэр өнгөтэй байна. (C ба D) (A) ба (B)-тэй ижил харагдацууд, липидүүдийг оруулаагүй. (E-ээс G хүртэл) RC-LH116-аас авсан Q1(E), Q2(F) болон Q3(G)-ийн томруулсан харагдац, бие биедээ нөлөөлдөг хажуугийн гинжүүдтэй. Устөрөгчийн холбоог хар тасархай шугамаар харуулав.
RC-LH116-д цэнэг салгах процесст электрон дамжуулалтад оролцдог RC QA болон QB UQ хоёулаа холболтын цэгүүддээ задардаг. Гэсэн хэдий ч RC-LH114-W-д QB хиноныг задалж чадаагүй бөгөөд доор дэлгэрэнгүй авч үзэх болно. QA болон QB хинонуудаас гадна хоёр хелатлагдсан UQ молекул (RC ба LH1 цагирагуудын хооронд байрладаг) нь RC-LH114-W бүтцэд сайн шийдэгдсэн толгойн бүлгүүдийн дагуу (тус тус Q1 ба Q2-д байрладаг) байрладаг. зай). Зураг 5C). Q1-д хоёр изопрен нэгж оноогдсон бөгөөд нягтралын зураглал нь Q2-ийн 10 изопренийн бүрэн сүүлийг тодорхойлно. RC-LH116-ийн бүтцэд гурван хелатлагдсан UQ10 молекул (Q1-ээс Q3 хүртэл, Зураг 5D) задлагдсан бөгөөд бүх молекулууд сүүлний туршид тодорхой нягтралтай байдаг (Зураг 5, D-ээс G хүртэл). Хоёр бүтцэд Q1 ба Q2-ийн хинон толгойн бүлгүүдийн байрлал маш сайн тогтвортой байдаг (Зураг S12F) бөгөөд тэдгээр нь зөвхөн RC-тэй харилцан үйлчилдэг. Q1 нь RC-LH114-W-ийн W зайны үүдэнд байрладаг (Зураг 1G ба 5, C, D ба E), Q2 нь QB холболтын цэгийн ойролцоо байрладаг (Зураг 5, C, D) ба F). Хадгалагдсан L-Trp143 ба L-Trp269 үлдэгдэл нь Q1 ба Q2-той маш ойрхон бөгөөд π-стекинг харилцан үйлчлэлийг бий болгодог (Зураг 5, E ба F, мөн Зураг S12). Q1-ийн дистал хүчилтөрөгчөөс 3.0 Å ялгарсан L-Gln88 нь хүчтэй устөрөгчийн холбоо үүсгэдэг (Зураг 5E); энэ үлдэгдэл нь хамгийн алслагдсан хамаарлаас бусад бүх RC-д хадгалагддаг (Зураг S13). L-Ser91 нь бусад ихэнх RC-д Thr-ийг консерватив байдлаар орлуулдаг (Зураг S13), Q1-ийн метил хүчилтөрөгчөөс 3.8 Ангстром бөгөөд сул устөрөгчийн холбоо үүсгэж болзошгүй (Зураг 5E). Q3 нь тодорхой харилцан үйлчлэлгүй мэт боловч RC-M дэд нэгж болон LH1-α 5-6 дэд нэгжийн хоорондох гидрофобик бүсэд байрладаг (Зураг 5, D ба G). Q1, Q2 ба Q3 эсвэл ойролцоох хелат хинонууд нь Tch. Gentle, Trv. Strain 970 болон Blc-д мөн шийдэгдсэн. Цахилдаг бүрхүүлийн бүтэц (9, 10, 12) нь RC-LH1 цогцолбор дахь хадгалагдсан туслах хинон холбох цэгийг заадаг (Зураг S12G). RC-LH116 дахь таван задарсан UQ нь өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографи (HPLC)-аар тодорхойлогдсон цогцолбор бүрийн 5.8±0.7-той сайн тохирч байгаа бол RC-LH114-W дахь гурван задарсан UQ нь дараах хэмжээнээс бага байна. Хэмжсэн 6.2±0.3 утга (Зураг S14) нь бүтцэд шийдэгдээгүй UQ молекулууд байгааг харуулж байна.
Псевдо-тэгш хэмтэй L ба M полипептидүүд тус бүр таван TMH агуулдаг бөгөөд нэг BChl димер, хоёр BChl мономер, хоёр бактериофаг (BPh) мономер, нэг гем бус төмөр болон нэг эсвэл хоёр UQ10 молекулуудыг нэгтгэсэн гетеродимер үүсгэдэг. Терминал кетон бүлэгт устөрөгчийн холбоо байгаа болон Rps-д хуримтлагдсанаар каротиноидууд нь цис-3,4-дегидрооргодопин гэж нэрлэгддэг M-дэд нэгжид багтдаг. Зүйлс (25). RC-H-ийн гаднах мембраны домэйн нь мембранд ганц TMH-ээр бэхлэгддэг. RC-ийн нийт бүтэц нь холбогдох зүйлийн (жишээ нь Rba) гурван дэд нэгж RC-тэй төстэй. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl болон BPh-ийн макроциклүүд, каротиноидын нуруу болон гем бус төмрийн давхаргууд нь эдгээр бүтцийн нягтралын хязгаарт давхцдаг бөгөөд QA цэг дэх UQ10 толгойн бүлэг болон RC-LH116 дээрх QB хинон нь давхцдаг (Зураг S15).
QB талбайн эзлэх хувь өөр өөр байдаг хоёр RC бүтэц байгаа нь QB хинон холболттой холбоотой тогтвортой конформацийн өөрчлөлтийг судлах шинэ боломжийг олгож байна. RC-LH116 цогцолборт QB хинон нь бүрэн холбогдсон "ойролцоох" байрлалд (26) байрладаг боловч RC-LH114-W-ийн тусгаарлалтад QB хинон байдаггүй. RC-LH114-W-д QB хинон байхгүй бөгөөд энэ нь гайхмаар зүйл юм, учир нь цогцолбор нь бүтцийн хувьд шийдэгдсэн QB хинонтой RC-LH116 цогцолбороос илүү идэвхтэй байдаг. Хэдийгээр хоёр LH1 цагираг нь ойролцоогоор зургаан хиноныг хелатжуулдаг боловч тав нь хаалттай RC-LH116 цагирагт бүтцийн хувьд шийдэгдсэн байдаг бол зөвхөн гурван нь нээлттэй RC-LH114-W цагирагт бүтцийн хувьд хязгаарлагдмал байдаг. Энэхүү бүтцийн эмгэг нэмэгдэж байгаа нь RC-LH114-W QB сайтуудын хурдан солигдох, цогцолбор дахь хиноны кинетикийн хурд, LH1 гогцоог гатлах магадлал нэмэгдэж байгааг харуулж байж магадгүй юм. RC-LH114-W-ийн RC QB сайтад UQ байхгүй байгаа нь илүү төвөгтэй, илүү идэвхтэй цогцолборын үр дүн байж болох бөгөөд RC-LH114-W-ийн QB сайт нь UQ эргэлтэд шууд хөлдсөн гэж бид үзэж байна. Тодорхой үе шат (QB сайт руу орох хаалга хаагдсан) нь энэ үйл ажиллагааны хэлбэрийг тусгадаг.
QB байхгүй бол L-Phe217-ийн UQ10 холболттой нийцэхгүй байрлалд эргэлдэх нь дагалдана, учир нь энэ нь сүүлний эхний изопрен нэгжтэй орон зайн мөргөлдөөнд хүргэнэ (Зураг 6A). Үүнээс гадна, илэрхий үндсэн конформацийн өөрчлөлтүүд, ялангуяа L-Phe217 нь QB холболтын халаас руу шилжсэн спираль де (TMH D ба E хоорондох гогцоонд богино спираль) болон L-Tyr223-ийн эргэлт (Зураг 6A) нь M-Asp45 хүрээтэй устөрөгчийн холбоог тасалж, QB холболтын цэгийн үүд хаалтыг хаах (Зураг 6B). Helix де эргэлдэх нь суурин дээрээ эргэлдэж, L-Ser209-ийн Cα нь 0.33Å-ээр шилжсэн бол L-Val221Cα нь 3.52Å-ээр шилжсэн. TMH D ба E-д ажиглагдахуйц өөрчлөлт байхгүй бөгөөд эдгээр нь хоёр бүтцэд давхцаж байна (Зураг 6A). Бидний мэдэж байгаагаар энэ нь QB талбайг хаадаг байгалийн RC-ийн анхны бүтэц юм. Бүрэн (QB-тэй холбогдсон) бүтэцтэй харьцуулж үзэхэд хиноныг багасгахаас өмнө хинон руу орохын тулд конформацийн өөрчлөлт шаардлагатай байдаг. L-Phe217 нь хинон толгойн бүлэгтэй π-давхаргын харилцан үйлчлэл үүсгэхийн тулд эргэлддэг бөгөөд мушгиа нь гадагшаа шилжиж, L-Gly222-ийн араг яс болон L-Tyr223-ийн хажуугийн гинж нь тогтвортой устөрөгчийн холбооны бүтэцтэй устөрөгчийн холбооны сүлжээ үүсгэх боломжийг олгодог (Зураг 6, А ба С).
(A) Голограмм (L гинж, улбар шар/M гинж, нил ягаан) болон апо (саарал) бүтцийн давхцсан хүүхэлдэйн кино, үүнд гол үлдэгдлүүдийг саваа хэлбэртэй дүрслэл хэлбэрээр харуулсан. UQ10-ийг шар зураасаар дүрсэлсэн. Цэгтэй шугам нь бүхэл бүтцэд үүссэн устөрөгчийн холбоог заана. (B ба C) Аполипопротеин болон бүхэл цагираг бүтцийн гадаргуугийн дүрслэл нь L-Phe217-ийн хажуугийн гинжин хүчилтөрөгчийг цэнхэр өнгөөр, L-Tyr223-ийг улаан өнгөөр ​​тус тус тодруулсан. L дэд нэгж нь улбар шар өнгөтэй; M ба H дэд нэгжүүд нь өнгөгүй байна. (D ба E) Аполипопротеин (D) ба бүхэл (E) RC QB цэгүүд [тус тус (A) өнгөөр ​​будна] болон Thermophilus thermophilus PSII (ногоон, хуванцар хинонтой цэнхэр; PDB ID: 3WU2) Тэгшлүүлнэ үү (58).
Гэнэтийн байдлаар, LH1-гүй QB дутагдалтай RC-үүдийн хэд хэдэн бүтэц байгаа ч энэхүү судалгаанд ажиглагдсан конформацийн өөрчлөлтийг өмнө нь мэдээлж байгаагүй. Үүнд Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) болон Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29)-ийн QB-ийн хомсдолын бүтэц багтдаг бөгөөд эдгээр нь бүгд QB-ийн нийт бүтэцтэй бараг ижил байдаг. 3PRC-ийг сайтар шалгаж үзэхэд LDAO (Лаурил Диметил Амин Исэл) угаалгын нунтаг молекулууд нь QB байрлалын үүдэнд холбогддог бөгөөд энэ нь хаалттай конформацид шилжихээс сэргийлж болзошгүйг тогтоожээ. Хэдийгээр LDAO нь 1EYS эсвэл 1OGV-д ижил байрлалд задардаггүй ч эдгээр RC-үүдийг ижил угаалгын нунтаг ашиглан бэлтгэдэг тул ижил үр нөлөө үзүүлж болзошгүй юм. Rba-ийн талст бүтэц. Цитохром c2-тэй хамтран талсжсан Сфаеройдс RC (PDB ID: 1L9B) нь мөн хаалттай QB талбайтай бололтой. Гэсэн хэдий ч энэ тохиолдолд RC-M полипептидийн N-төгсгөлийн бүс (Q спираль дээрх Тир үлдэгдлийн H холбоогоор дамжуулан QB холболтын талбайтай харилцан үйлчилдэг) нь байгалийн бус хэлбэрийг авдаг бөгөөд QB хэлбэр өөрчлөлтийг цаашид судлаагүй болно (30). RC-LH114-W бүтцэд M полипептидийн ийм төрлийн деформацийг бид хараагүй нь тайвшруулж байгаа бөгөөд энэ нь RC-LH116 RC-ийн N-төгсгөлийн бүстэй бараг ижил юм. Мөн угаалгын нунтаг дээр суурилсан LH1 антенныг устгасны дараа PDB дахь аполипопротеин RC-үүд арилсан бөгөөд энэ нь RC болон эргэн тойрон дахь LH1 цагирагны дотоод гадаргуугийн хоорондох зай дахь дотоод хинон сан болон липидийг арилгасан гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй (31, 32). RC нь задардаг QB хиноноос бусад бүх кофакторуудыг хадгалдаг тул үйл ажиллагаагаа хадгалсаар байдаг бөгөөд энэ нь бага тогтвортой бөгөөд бэлтгэлийн явцад ихэвчлэн алдагддаг (33). Үүнээс гадна, RC-ээс LH1 болон байгалийн циклийн липидийг зайлуулах нь цэнэгээс тусгаарлагдсан P+QB төлөвийн ашиглалтын хугацаа богиносох зэрэг функцүүдэд нөлөөлж болохыг мэддэг (31, 34, 35). Тиймээс RC-ийг тойрсон орон нутгийн LH1 цагираг байгаа нь "хаалттай" QB талбайг хадгалж, улмаар QB-ийн ойролцоох орон нутгийн орчныг хадгалж магадгүй гэж бид таамаглаж байна.
Аполипопротеин (QB хинонгүй) болон бүрэн бүтэц нь QB талбайн эргэлтийн зөвхөн хоёр агшин зургийг илэрхийлдэг боловч хэд хэдэн үйл явдлын дарааллыг төлөөлөхөөс илүүтэй гидрохиноноор дахин холбогдол үүсэхээс сэргийлж холболтыг хааж болно гэсэн шинж тэмдэг байдаг. Аполипопротеины QB талбайн ойролцоо хинолол ба хиноны харилцан үйлчлэл өөр байж болох бөгөөд энэ нь RC-ээр татгалзахад хүргэдэг. Конформацийн өөрчлөлт нь хиноны холболт ба бууралтад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж удаан хугацаанд санал болгосон. Харанхуй дасан зохицсоны дараа хөлдөөсөн RC-ийн хиноныг бууруулах чадвар буурсан (36); Рентген талстографи нь энэхүү гэмтэл нь QB хинонууд идэвхтэй проксимал байрлалаас ойролцоогоор 4.5 Å зайд "дистал" конформацид баригдсантай холбоотой болохыг харуулж байна (26), 37). Энэхүү дистал холболтын конформаци нь аполипопротеин ба бүтэн цагираг бүтцийн хоорондох завсрын төлөвийн агшин зургийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь хинонтой анхны харилцан үйлчлэл болон QB талбай нээгдсэний дараа явагддаг.
Тодорхой фототрофик бактери ба цианобактери, замаг, ургамлын PSII цогцолборт байдаг II төрлийн RC нь бүтцийн болон үйл ажиллагааны хадгалалттай байдаг (38). Зураг 6-д үзүүлсэн бүтцийн тохируулга (D ба E) нь PSII RC болон бактерийн RC цогцолборын QB талбайн хоорондох ижил төстэй байдлыг онцолж өгдөг. Энэхүү харьцуулалт нь хинон холбох ба бууруулах нягт холбоотой системийг судлах загвар болж ирсэн. Өмнөх нийтлэлүүдэд конформацийн өөрчлөлт нь хинонуудын PSII бууралттай хамт явагддаг гэж үзсэн (39, 40). Тиймээс RC-ийн хувьслын хадгалалтыг харгалзан үзвэл өмнө нь ажиглагдаагүй энэхүү холбох механизм нь хүчилтөрөгчтэй фототрофик ургамлын PSII RC-ийн QB талбайд мөн хамааралтай байж болно.
Rps ΔpufW (шошгогүй pufW устгал) болон PufW-His (байгалийн pufW локусаас илэрхийлэгдсэн C-терминал 10x His-шошготой уураг-W) омгууд. palustris CGA009-ийг бидний өмнөх ажилд (16) тайлбарласан болно. Эдгээр омгууд болон изоген зэрлэг төрлийн эцэг эхийг хөлдөөгчнөөс цөөн тооны эсийг PYE (тус бүр 5 г литр -1) (LB-д -80 °C-д хадгалсан, 50% (w/v) глицерол) уураг, мөөгөнцрийн ханд болон сукцинат) агар [1.5% (w/v)] агуулсан хавтан дээр туузаар зурж гаргаж авсан. Хавтанг агааргүй нөхцөлд харанхуйд өрөөний температурт хонуулж, дараа нь OSRAM 116-W галоген чийдэнгийн (RS Components, UK) өгсөн цагаан гэрлээр (~50 μmolm-2 s-1) 3-5 хоногийн турш нэг колони гарч иртэл гэрэлтүүлсэн. 0.1% (w/v) казамин хүчил (цаашид M22 гэх)-ээр баяжуулсан 10 мл M22+ орчин (41)-ыг нэг колони ашиглан тарьсан. Өсгөврийг хүчилтөрөгч багатай нөхцөлд харанхуйд 34°C температурт 180 эрг/мин-д 48 цагийн турш сэгсэрч ургуулсан бөгөөд дараа нь 70 мл өсгөврийг ижил нөхцөлд 24 цагийн турш тарьсан. 1 мл эзэлхүүнтэй хагас аэробик өсгөврийг ашиглан 30 мл-ийн бүх нийтийн шурагтай тунгалаг шилэн саванд 30 мл M22 орчинг тарьж, ариутгасан соронзон хүчээр хутгагч саваагаар 48 цагийн турш хутгаж (~50μmolm-2 s-1) цацрагаар цацсан. Дараа нь 30 мл өсгөврийг ижил нөхцөлд ойролцоогоор 1 литр өсгөврөөр тарьж, дараа нь ойролцоогоор 9 литр өсгөврийг ~200 μmolm-2 s-1-д 72 цагийн турш гэрэлтүүлэхэд ашигласан. Эсүүдийг 7132 RCF-д 30 минутын турш центрифугээр хурааж, ~10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)-д дахин уусгаж, шаардлагатай болтол -20°C-д хадгалсан.
Гэсгээсний дараа дахин дүүрсэн эсүүдэд дезоксирибонуклеаза I (Merck, UK), лизоцим (Merck, UK) болон хоёр Roche голоэнзим протеазын дарангуйлагч шахмал (Merck, UK)-ийн талстуудыг нэмнэ. 20,000 psi Францын даралтын эсэд (Aminco, USA) эсүүдийг 8-12 удаа задалсан. Эвдэрээгүй эсүүд болон уусдаггүй хог хаягдлыг 18,500 RCF-д 4°C-д 15 минутын турш центрифугээр зайлуулсны дараа мембраныг пигменттэй лизатаас 113,000 RCF-д 43,000°C-д 2 цагийн турш центрифугээр тунадасжуулсан. Уусдаг фракцийг хаяж, өнгөт мембраныг 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)-д дахин дүүргэж, харагдахуйц агрегатууд байхгүй болтол нэгэн төрлийн болгоно. Дээвэртэй мембраныг 2% (w/v) β-DDM агуулсан 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) (Анатрас, АНУ)-д 4°C-д харанхуй газар 1 цагийн турш зөөлөн хутгаж инкубацлав. Дараа нь 70°C-д центрифугээр хийж, 150,000 RCF-ийг 4°C-д 1 цагийн турш уусгаж, үлдэгдэл уусдаггүй бодисыг зайлуулав.
ΔpufW омгийн уусгагч мембраныг гурван баганын эзэлхүүнтэй (CV) холбох буфер [20 мМ трис-HCl (рН 8.0) агуулсан 0.03% (w / v) β-DDM] бүхий 50 мл DEAE Сефарозын ион солилцооны баганад түрхсэн. Баганыг хоёр CV холбох буфераар угааж, дараа нь баганыг 50 мМ NaCl агуулсан хоёр холбох буфераар угаана. RC-LH116 цогцолборыг 1.75 CV дээр 150-300 мМ NaCl шугаман градиентаар (холбох буферт), үлдсэн холбох цогцолборыг 0.5 CV дээр 300 мМ NaCl агуулсан холбох буфераар элюцидсэн. 250-1000 нм-ийн хоорондох шингээлтийн спектрийг цуглуулж, шингээлтийн харьцаа (A880/A280) нь 1-ээс их фракцыг 880-280 нм-д байлгаж, холбох буферт хоёр удаа шингэлж, мөн адил процедурыг DEAE Цэвэршүүлэх багана дээр дахин ашиглана. A880/A280 харьцаа нь 1.7-оос дээш, A880/A805 харьцаа нь 3.0-оос дээш фракцуудыг шингэлж, ионы солилцооны гурав дахь шатыг гүйцэтгэж, A880/A280 харьцаа нь 2.2-оос дээш, A880/A805 харьцаа нь 5.0-оос дээш фракцуудыг хадгална. Хэсэгчилсэн цэвэршүүлсэн цогцолборыг Amicon 100,000 молекул жингийн таслах (MWCO) төвөөс зугтах шүүлтүүрт (Merck, UK) ~2 мл хүртэл баяжуулж, 200 мМ NaCl буфер агуулсан Superdex 200 16/600 хэмжээтэй хасах багана (GE Healthcare, US) дээр ачаалж, дараа нь 1.5 CV-д ижил буферт элюулжуулсан. Хэмжээ хасах фракцийн шингээлтийн спектрийг цуглуулж, шингээлтийн спектрийг 2.4-өөс дээш A880/A280 харьцаатай, 5.8-аас 100 A880 хүртэл A880 харьцаатайгаар баяжуулж, крио-TEM тор бэлтгэх эсвэл хадгалахад нэн даруй ашиглана. Шаардлагатай болтол -80°C-д хадгална.
PufW-His омгийн уусгагч мембраныг IMAC буферт (GE Healthcare) 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose баганад (200 мМ NaCl ба 0.03% (w/w) агуулсан 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)) түрхсэн. v) β-DDM]. Баганыг таван CV IMAC буфераар, дараа нь 10 мМ гистидин агуулсан таван CV IMAC буфераар угаасан. Гол цогцолборыг баганаас 100 мМ гистидин агуулсан таван IMAC буфераар элюцидсэн. RC-LH114-W цогцолбор агуулсан фракцыг Amicon 100,000 MWCO шүүлтүүр (Merck, UK)-ээр тоноглогдсон хутгасан саванд ~10 мл хүртэл төвлөрүүлж, холбох буфераар 20 удаа шингэлж, дараа нь 25 мл-д нэмнэ. DEAE Sepharose баганад буферт холбогдсон дөрвөн CV-г урьдчилан ашигладаг. Баганыг дөрвөн CV холболтын буфераар угааж, дараа нь 0-ээс 100 мМ NaCl шугаман градиент дээр (холбох буферт) найман CV дээр цогцолборыг элюцид оруулж, үлдсэн дөрвөн CV-г 100 мМ холболтын буферт агуулна. Натрийн хлорид дээр элюцидсэн үлдэгдэл цогцолборуудыг A880/A280 харьцаа 2.4-өөс дээш, A880/A805 харьцаа 4.6-аас дээш фракцтай хослуулан Amicon 100,000 MWCO төвөөс зугтах шүүлтүүрт ~2 мл хүртэл төвлөрүүлж, урьдчилан 1.5 CV IMAC-аар дүүргэсэн. Буфер нь Superdex 200 16/600 хэмжээтэй хасах баганыг тэнцвэржүүлж, дараа нь ижил буферт 1.5 CV дээр элюцид оруулна. Хэмжээг хасах фракцуудын шингээлтийн спектрүүдийг цуглуулж, шингээлтийн спектрүүдийг 2.1-ээс дээш A880/A280 харьцаатай, 4.6-аас дээш A880/A805 харьцаатай 100 A880-аар төвлөрүүлж, хөлдөөсөн TEM тор бэлтгэхэд шууд ашиглах эсвэл шаардлагатай болтол -80°C-д хадгалах.
Бага температурт TEM тор бэлтгэхэд Leica EM GP шумбалтын хөлдөөгч ашигласан. Цогцолборыг IMAC буферт A880 of 50 хүртэл шингэлж, дараа нь 5μl-ийг шинээр гэрэлтсэн QUANTIFOIL 1.2/1.3 нүүрстөрөгчөөр бүрсэн зэс тор (Agar Scientific, UK) дээр ачаалсан. Торыг 20°C температурт болон 60% харьцангуй чийгшилтэй орчинд 30 секундын турш инкубацилж, дараа нь 3 секундын турш хатаагаад, дараа нь -176°C температурт шингэн этан дотор бөхөөнө.
RC-LH114-W цогцолборын өгөгдлийг 300 кВ хурдатгалын хүчдэл дээр ажилладаг, 130,000× нэрлэсэн томруулалттай, 20 эВ энергитэй Titan Krios микроскопоор eBIC (Электрон Биоижуулах Төв) (Британийн Алмаз Гэрлийн Эх үүсвэр) дээр тэмдэглэсэн. Өгөгдөл цуглуулахын тулд тоолох горимд зургийг K2 оргил илрүүлэгчтэй Gatan 968 GIF Quantum ашигласан. Тохируулсан пикселийн хэмжээ нь 1.048Å, тунгийн хурд нь 3.83 e-Å-2s-1. Киног 11 секундын дотор цуглуулж, 40 хэсэгт хуваасан. Нүүрстөрөгчийн бүрсэн хэсгийг ашиглан микроскопыг дахин фокуслаад дараа нь нүх тус бүрээс гурван кино цуглуулсан. Нийтдээ 3130 кино цуглуулсан бөгөөд фокусын дефокусын утга нь -1-ээс -3μm хооронд байв.
RC-LH116 цогцолборын өгөгдлийг Астерберигийн Био бүтцийн лабораторид (Лийдсийн Их Сургууль, Их Британи) ижил микроскоп ашиглан цуглуулсан. Өгөгдлийг 130 к томруулалттай тоолох горимд цуглуулж, пикселийн хэмжээг 4.6 e-Å-2s-1 тунгаар 1.065 Å хүртэл тохируулсан. Киног 12 секундын дотор бичиж, 48 хэсэгт хуваасан. Нийтдээ -1-ээс -3μm хооронд дефокусын утгатай 3359 кино цуглуулсан.
Бүх өгөгдөл боловсруулалтыг Relion 3.0 дамжуулах хоолойд (42) гүйцэтгэнэ. Тунг жинлэх замаар цацрагийн хөдөлгөөнийг засахын тулд Motioncorr 2 (43)-г ашиглана уу, дараа нь CTFFIND 4.1 (44)-г ашиглан CTF (тодосгогч дамжуулалтын функц) параметрийг тодорхойлно уу. Эдгээр анхны боловсруулалтын үе шатуудын дараах ердийн фотомикрографуудыг Зураг 2-т үзүүлэв. S16. Автомат сонголтын загварыг 250 пикселийн хүрээ болон лавлагаагүй хоёр хэмжээст (2D) ангилалд 1000 орчим бөөмсийн 250 пикселийг гараар сонгож, улмаар дээжийн бохирдолд нийцсэн эсвэл ялгарах шинж чанаргүй ангиллуудыг үгүйсгэснээр үүсгэнэ. Дараа нь бүх микрофотограф дээр автомат сонголт хийсэн бөгөөд RC-LH114-W нь 849,359 бөөм, RC-LH116 цогцолбор нь 476,547 бөөм байв. Сонгосон бүх бөөмс нь лавлагаа бус 2 хэмжээст ангиллын хоёр үе шатыг давсан бөгөөд туршилт бүрийн дараа нүүрстөрөгчийн талбайтай нийцсэн, дээжийн бохирдолтой, илэрхий шинж чанаргүй эсвэл хүчтэй давхцсан бөөмсийг няцааж, RC-LH114-W болон RC-LH116-ийн 3 хэмжээст ангилалд тус тус 772,033 (90.9%) болон 359,678 (75.5%) бөөмсийг ашигласан. Анхны 3 хэмжээст лавлагаа загварыг стохастик градиент бууралтын аргаар үүсгэсэн. Анхны загварыг лавлагаа болгон ашиглан сонгосон бөөмсийг 3 хэмжээст ангилалд дөрвөн ангилалд ангилсан. Энэ ангилалд байгаа загварыг лавлагаа болгон ашиглан хамгийн том ангилалд байгаа бөөмс дээр 3 хэмжээст цэвэршүүлэлт хийж, дараа нь анхны 15Å нам дамжуулалтын шүүлтүүрийг ашиглан уусгагчийн талбайг бүрхэж, зөөлөн ирмэгийн 6 пиксел нэмж, дээд илрүүлэгчийн Gatan K2 оргил модуляцийн дамжуулах функцийг засахын тулд пикселүүдийг дараа нь боловсруулна. RC-LH114-W өгөгдлийн багцын хувьд энэхүү анхны загварыг маскны ирмэг дээрх хүчтэй нягтралыг (UCSF Chimera дахь цөм цогцолборын нягтралаас салгасан) арилгаж өөрчилсөн. Үр дүнд хүрсэн загваруудыг (RC-LH114-W ба RC-LH116-ийн нягтрал нь тус тус 3.91 ба 4.16 Å) 3D ангиллын хоёр дахь шатны лавлагаа болгон ашигласан. Ашигласан бөөмсийг анхны 3D ангилалд бүлэглэсэн бөгөөд хөрштэй хүчтэй хамааралгүй. Давхцаж эсвэл илэрхий бүтцийн шинж чанар дутмаг байна. 3D ангиллын хоёр дахь шатны дараа хамгийн өндөр нягтралтай ангиллыг сонгосон [RC-LH114-W-ийн хувьд нэг ангилал нь 377,703 бөөм (44.5%), RC-LH116-ийн хувьд нийт 260,752 бөөм (54.7%) гэсэн хоёр ангилал байдаг бөгөөд эдгээр нь зөвхөн анхны эргэлтийн дараа бага зөрүүтэй зэрэгцсэн үед л ижил байна]. Сонгосон хэсгүүдийг 400 пикселийн хайрцагт дахин гаргаж аваад 3 хэмжээст цэвэршүүлэлтээр цэвэршүүлдэг. Уусгагч маскыг анхны 15Å нам давтамжийн шүүлтүүр, 3 пикселийн газрын зургийн өргөтгөл болон 3 пикселийн зөөлөн маск ашиглан үүсгэдэг. Бөөм бүрийн CTF цэвэршүүлэлт, бөөм бүрийн хөдөлгөөний залруулга болон бөөм бүрийн CTF цэвэршүүлэлтийн хоёр дахь шатыг ашиглан үүссэн бүтцийг улам боловсронгуй болгохын тулд алхам бүрийн дараа 3 хэмжээст цэвэршүүлэлт, уусгагч маск болон дараах боловсруулалтыг гүйцэтгэдэг. FSC (Фурье бүрхүүлийн корреляцийн коэффициент)-ийн 0.143 хязгаарын утгыг ашиглан RC-LH114-W болон RC-LH116-ийн эцсийн загваруудын нягтрал нь тус тус 2.65 ба 2.80Å байна. Эцсийн загварын FSC муруйг Зураг 2-т үзүүлэв. S17.
Бүх уургийн дарааллыг UniProtKB-ээс татаж авсан: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45)-г ашиглан RC-L, RC-M болон RC-H-ийн уургийн дараалал болон Rba-ийн талст бүтцийг агуулсан RC-ийн гомологийн загварыг бүтээв. sphaeroides RC-г загвар болгон ашигласан (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera дахь “тохируулах газрын зураг” хэрэгслийг ашиглан үүсгэсэн загварыг газрын зурагт (47) тохируулж, уургийн бүтцийг сайжруулж, кофактор [4×BChlα (мономерын сангийн үлдэгдэл нэр = BCL), 2×BPhα (BPH), нэг эсвэл хоёр төрлийн UQ10 (U10), нэг гем бус төмөр (Fe) болон нэг 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)]-г Coot (48) ашиглан нэмнэ. QAK нь мономерын санд байхгүй тул PHENIX (49) дахь eLBOW хэрэгслийг ашиглан параметрчилсэн.
Дараа нь LH1 дэд нэгжийг бүтээсэн. Эхэндээ PHENIX (49) дахь автомат бүтээх хэрэгслийг ашиглан газрын зураг болон LH1-α ба LH1-β уургийн дарааллыг оролт болгон ашиглан LH1 дарааллын хэсгийг автоматаар бүтээхэд ашигласан. Хамгийн бүрэн гүйцэд LH1 дэд нэгжийг сонгоод, гаргаж аваад Coot руу ачаалж, алга болсон дарааллыг гараар нэмж, хоёр BCl a (BCL) болон спириллоксантин (CRT) нэмэхээсээ өмнө бүхэл бүтцийг гараар сайжруулна [холбогдох Rps-ийн дагуу LH1 цогцолборын нягтрал ба мэдэгдэж буй каротиноидын агууламж. Зүйлс (17)]. LH1 дэд нэгжийг бүрэн хуулж, UCSF Chimera “Докинг газрын зургийн хэрэгсэл”-ийг ашиглан LH1 нягтралын зэргэлдээх загвар бус хэсэгт байрлуулж, дараа нь Coot-д сайжруулна; бүх LH1 дэд нэгжийг загварчлах хүртэл үйл явцыг давтана. RC-LH114-W бүтцийн хувьд Coot дахь хуваарилагдаагүй нягтралыг гаргаж авснаар уургийг USCF Chimera газрын зураг дээрх үлдсэн уургийн бус бүрэлдэхүүн хэсгүүдээс сегментчилдэг бөгөөд Autobuild хэрэгслийг ашиглан анхны загварыг бий болгож, үлдсэн дэд нэгжүүдийг (уураг-W) загварчилна. PHENIX (49)-д. Coot (48)-д үүссэн загварт алга болсон дарааллыг нэмж, дараа нь дэд нэгжийг бүхэлд нь гараар боловсронгуй болгоно. Үлдсэн хуваарилагдаагүй нягтрал нь липидийн (CDL = CDL, POPC = 6PL ба POPG = PGT-ийн PDB мономер сангийн ID), β-DDM угаалгын нунтаг (LMT) болон UQ10 молекулуудын (U10) хослолд тохирно. Загварын статистик болон тохирох байдлын харааны чанарыг цаашид сайжруулах боломжгүй болтол анхны бүрэн загварыг төгс болгохын тулд Coot (48)-д PHENIX оновчлол (49) болон гараар оновчлолыг ашиглана. Эцэст нь, орон нутгийн газрын зургийг хурцлахын тулд LocScale (50) ашиглана уу, дараа нь хуваарилагдаагүй нягтралыг загварчлах, автомат болон гараар оновчлох хэд хэдэн циклийг гүйцэтгэнэ үү.
Тус тусын нягтралдаа байрлуулсан пептид, кофактор болон бусад липид ба хинонуудыг Зураг 1 ба 2-т үзүүлэв. S18-аас S23 хүртэл. Эцсийн загварын статистик мэдээллийг Хүснэгт S1-д үзүүлэв.
Өөрөөр заагаагүй бол UV/Vis/NIR шингээлтийн спектрүүдийг Cary60 спектрофотометр (Agilent, USA) дээр 250 нм-ээс 1000 нм хүртэл 1 нм интервалтайгаар, 0.1 секундын интеграцийн хугацаатайгаар цуглуулсан.
Дээжийг 2 мм-ийн замтай кварц кюветэд A880-ийн 1 хүртэл шингэлж, 400-1000 нм хоорондох шингээлтийн спектрийг цуглуулна. Дугуй дихроик спектрийг Jasco 810 спектрополиметр (Jasco, Япон) дээр 400 нм-ээс 950 нм-ийн хоорондох 1 нм интервалтайгаар 20 нм мин-1 сканнердах хурдаар цуглуулсан.
Молийн устах коэффициентийг цөм цогцолборыг ойролцоогоор 50 A880 хүртэл шингэлж тодорхойлно. 10μl эзэлхүүнийг 990μl холбох буфер буюу метанолд шингэлж, BChl задралыг багасгахын тулд шингээлтийн спектрийг нэн даруй цуглуулна. Метанолын дээж бүрийн BChl агууламжийг 54.8 mM-1 см-1-ийн 771 нм дэх устах коэффициентоор тооцоолж, устах коэффициентийг (51) тодорхойлсон. Хэмжсэн BChl концентрацийг 32 (RC-LH114-W) эсвэл 36 (RC-LH116)-д хувааж, цөм цогцолборын концентрацийг тодорхойлж, дараа нь буферт цуглуулсан ижил дээжийн шингээлтийн спектрийг тодорхойлоход ашиглана. Устгах коэффициент. Зэрэгцээ. Дээж бүрт гурван давтан хэмжилт хийж, BChl Qy максимумын дундаж шингээлтийг тооцоололд ашигласан. 878 нм-д хэмжсэн RC-LH114-W-ийн устах коэффициент нь 3280±140 мМ-1 см-1 байсан бол 880 нм-д хэмжсэн RC-LH116-ийн устах коэффициент нь 3800±30 мМ-1 см-1 байв.
UQ10-ийг (52)-д үзүүлсэн аргын дагуу тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Товчхондоо, урвуу фазын HPLC (RP-HPLC)-ийг Agilent 1200 HPLC системийг ашиглан гүйцэтгэсэн. Ойролцоогоор 0.02 нмоль RC-LH116 эсвэл RC-LH114-W-ийг 0.02% (w/v) төмрийн хлорид агуулсан 50μl 50:50 метанол:хлороформд уусгаж, урьдчилан тэнцвэржүүлсэн Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 мм-ийг ×25 см-ийн баганан дээр 40°C-т 1 мл-1 мин-1-д HPLC уусгагч (80:20 метанол:2-пропанол)-д уусгана. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноид) болон 780 нм (BChl)-д шингээлтийг хянахын тулд HPLC уусгагчаар изократ элюци хийж 1 цагийн турш гүйцэтгэнэ. 275 нм хроматограммын оргил үеийг 25.5 минутын дараа нэгтгэсэн бөгөөд энэ нь өөр илрүүлж болох нэгдлүүдийг агуулаагүй болно. Нэгтгэсэн талбайг цэвэр стандартыг 0-ээс 5.8 нмоль хүртэл тарьснаас тооцоолсон тохируулгын муруйд үндэслэн гаргаж авсан UQ10-ийн молийн хэмжээг тооцоолоход ашигладаг (Зураг S14). Дээж бүрийг гурван давталтаар шинжилсэн бөгөөд мэдээлсэн алдаа нь дундаж утгын SD-тэй тохирч байна.
Хамгийн их Qy шингээлт нь 0.1-тэй RC-LH1 цогцолбор агуулсан уусмалыг 30 μM бууруулсан морины зүрхний цитохром c2 (Merck, UK) болон 0-50 μMUQ2 (Merck, UK) ашиглан бэлтгэсэн. UQ2 концентраци тус бүр дээр гурван 1 мл дээж бэлтгэж, хэмжилт хийхээс өмнө харанхуйд бүрэн дасан зохицохын тулд 4°C-д харанхуйд хонуулсан. Уусмалыг 300 нм дөл/500 шугаман тор, 1.24 мм оролт, 0.12 мм дунд болон 0.6 мм гаралтын зүсэлттэй OLIS RSM1000 модульчлагдсан спектрофотометрт хийсэн. Өдөөлтийн гэрлийг оруулахгүйн тулд дээжийн фотогуур болон лавлах фотоүржүүлэгч хоолойн үүдэнд 600 нм урт нэвтрүүлэх шүүлтүүр байрлуулсан. Шингээлтийг 550 нм-т 0.15 секундын интеграцийн хугацаатайгаар хянасан. Өдөөлтийн гэрлийг 880 нм M880F2 LED (Гэрэл ялгаруулдаг диод) (Thorlabs Ltd., UK)-аас DC2200 хянагч (Thorlabs Ltd., UK)-аар дамжуулан 90%-ийн эрчимтэй шилэн кабелиар дамжуулан ялгаруулж, гэрлийн эх үүсвэр рүү 90° өнцгөөр ялгаруулдаг. Хэмжих цацраг нь дээжинд анх шингээгдээгүй аливаа гэрлийг буцаахын тулд толины эсрэг байрладаг. 50 секундын гэрэлтүүлэг эхлэхээс өмнө 10 секундын турш шингээлтийг хянана. Дараа нь хинолол нь цитохром c23+-ийг хэрхэн аяндаа бууруулж байгааг үнэлэхийн тулд шингээлтийг харанхуйд 60 секундын турш хянасан (түүхий өгөгдлийг S8 зурагнаас үзнэ үү).
Өгөгдлийг 0.5-10 секундын дотор шугаман анхны хурдыг тохируулж (UQ2-ийн концентрацаас хамаарч), UQ2-ийн концентраци тус бүрийн гурван дээжийн хурдыг дундажлах замаар боловсруулсан. Харгалзах устах коэффициентоор тооцоолсон RC-LH1 концентрацийг хурдыг каталитик үр ашиг болгон хувиргахад ашигласан бөгөөд Origin Pro 2019 (OriginLab, АНУ)-д зурсан бөгөөд Km болон Kcat-ийн илэрхий утгыг тодорхойлохын тулд Michaelis-Menten загварт тохируулсан.
Түр зуурын шингээлтийн хэмжилтийн хувьд RC-LH1 дээжийг 50 мМ натрийн аскорбат (Merck, АНУ) болон 0.4 мМ Тербутин (Merck, АНУ) агуулсан IMAC буферт ~2μM хүртэл шингэлсэн. Аскорбины хүчил нь тахилын электрон донор болгон, терт-бутаклофенийг QB дарангуйлагч болгон ашиглаж, гол RC донор нь хэмжилтийн процессын туршид буурсан (өөрөөр хэлбэл фотоисэлдээгүй) хэвээр байгаа эсэхийг баталгаажуулдаг. Лазер зам дахь дээж нь өдөөлтийн импульсийн хооронд харанхуйд дасан зохицох хангалттай хугацаатай байгаа эсэхийг баталгаажуулахын тулд ойролцоогоор 3 мл дээжийг 2 мм-ийн оптик замын урттай өөрчлөн эргэлддэг нүдэнд (ойролцоогоор 0.1 м диаметртэй, 350 RPM) нэмнэ. ~100-fs лазер импульс ашиглан дээжийг 880 нм-т 1 кГц давталтын хурдаар (NIR-д 20 нЖ эсвэл Vis-д 100 нЖ) өдөөхийн тулд Ti: Sapphire лазер системийг (Spectra Physics, АНУ) олшруулна. Өгөгдөл цуглуулахаасаа өмнө дээжийг өдөөх гэрэлд 30 орчим минут байлгана. Өртөх нь QA идэвхгүйжүүлэхэд хүргэдэг (магадгүй QA-г нэг эсвэл хоёр удаа бууруулж болзошгүй). Гэхдээ энэ үйл явц нь буцаах боломжтой гэдгийг анхаарна уу, учир нь удаан хугацааны харанхуй дасан зохицох дараа RC нь QA идэвхжилдээ аажмаар эргэн ордог. Helios спектрометр (Ultrafast Systems, АНУ)-ыг -10-аас 7000 ps хүртэл хойшлуулах хугацаатай түр зуурын спектрийг хэмжихэд ашигласан. Өгөгдлийн багцыг задалж, дараа нь нэгтгэж, стандартчилахын тулд Surface Xplorer програм хангамж (Ultrafast Systems, АНУ) ашиглана уу. Хосолсон өгөгдлийн багцыг ашиглан задралтай холбоотой дифференциал спектрийг авахын тулд CarpetView програм хангамжийн багцыг (Light Conversion Ltd., Литва) ашиглана уу эсвэл Origin (OriginLab, АНУ) дахь нэг долгионы урттай спектрийн хувьсалд тохирохын тулд багажийн хариу үйлдэлтэй олон экспонентийг холбодог функцийг ашиглана уу.
Дээр дурдсанчлан (53), RC болон захын LH2 антенн хоёуланг нь агуулаагүй LH1 цогцолбор агуулсан фотосинтезийн хальс бэлтгэсэн. Мембраныг 20 мМ трис (рН 8.0)-д шингэлж, дараа нь 2 мм-ийн оптик замтай кварц кюветэд ачаалсан. 30нЖ лазер импульс ашиглан дээжийг 540 нм-т -10-аас 7000 ps хүртэл хойшлуулах хугацаатайгаар өдөөсөн. Rps pal дээжийн хувьд өгөгдлийн багцыг тайлбарласны дагуу боловсруулна.
Мембраныг 150,000 RCF-д 4°C-д 2 цагийн турш центрифугээр нунтаглаж, дараа нь 880 нм-д шингээлтийг нь 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) болон 200 мМ NaCl-д дахин уусгасан. Мембраныг 2% (w/v) β-DDM-д 4°C-д харанхуйд 1 цагийн турш аажмаар хутгаж уусгана. Дээжийг 100 мМ триэтиламмони карбонат (рН 8.0) (TEAB; Merck, UK)-д 2.5 мг мл-1 уургийн концентрацитай болтол шингэлсэн (Bio-Rad шинжилгээ). Цаашдын боловсруулалтыг өмнө нь нийтэлсэн арга (54)-аас эхлэн 50 мкг уургийг 1% (w/v) натрийн лаурат агуулсан нийт 50 мкл TEAB болгон шингэлж эхэлсэн (Merck, UK). 60 секундын турш хэт авиан шинжилгээ хийсний дараа 37°C-д 30 минутын турш 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, UK)-ээр бууруулсан. S-алкилжуулалтын хувьд дээжийг 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, UK)-ээр өсгөвөрлөж, 200 мМ изопропанолын уусмалаас өрөөний температурт 10 минут нэмнэ. Протеолитик задралыг 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C холимог (Promega UK) нэмж, 37°C-д 3 цагийн турш өсгөвөрлөнө. Лаурат гадаргуугийн идэвхт бодисыг 50 мкл этил ацетат болон 10 мкл 10% (v/v) LC зэрэглэлийн трифтор цууны хүчил (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) нэмж, 60 секундын турш хутгаж гаргаж авсан. Фазын ялгалтыг 15,700 RCF-д 5 минутын турш центрифугээр сайжруулсан. Үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу пептид агуулсан доод фазыг болгоомжтой соруулж, давсгүйжүүлэхийн тулд C18 эргэдэг баганыг (Thermo Fisher Scientific, UK) ашигласан. Вакуум центрифугээр хатаасны дараа дээжийг 0.5% TFA болон 3% ацетонитрилд уусгаж, 500 нг-ийг өмнө нь дэлгэрэнгүй тайлбарласан системийн параметрүүдийг ашиглан нанофлоудын RP хроматографи болон массын спектрометрээр шинжилсэн.
Rps. palustris proteome мэдээллийн санг хайхын тулд уургийг тодорхойлох болон тоон үзүүлэлтэд MaxQuant v.1.5.3.30 (56)-г ашиглана уу (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Массын спектрометрийн протеомикийн өгөгдлийг PXD020402 өгөгдлийн багц танигч дор PRIDE түншийн репозитороор дамжуулан ProteomeXchange Alliance-д хадгалсан.
RPLC-ээр электрошүршигч ионжуулалтын масс спектрометрээр хосолсон шинжилгээнд RC-LH1 цогцолборыг зэрлэг төрлийн Rps-ээс бэлтгэсэн. Өмнө нь нийтлэгдсэн аргыг (16) ашиглан palustris эсүүдэд үүссэн уургийн концентраци нь 20 мМ Hepes (рН 7.8), 100 мМ NaCl болон 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad шинжилгээ)) DDM-д 2 мг мл-1 байв. Үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу 2 хэмжээст цэвэршүүлэх хэрэгсэл (GE Healthcare, USA) ашиглан 10 мкг уургийг тунадасжуулах аргаар гаргаж аваад тунадасыг 20 мкл 60% (v/v) шоргоолжны хүчил (FA), 20% (v/v) ацетонитрил болон 20% (v/v) усанд уусгана. Таван микролитрийг RPLC (Dionex RSLC)-ээр масс спектрометрээр (Maxis UHR-TOF, Bruker) хосолсон шинжилгээнд хамруулсан. 60°C ба 100μlmin -1 температурт MabPac 1.2×100 мм баганыг (Thermo Fisher Scientific, UK) ашиглан 85% (v / v) уусгагч A [0.1% (v / v) FA ба 0.02% (V/v) TFA усан уусмал]-ын градиенттайгаар 85% (v/v) уусгагч B [90%(v/v) ацетонитрил TFA-д 0.1%(v/v) FA ба 0.02%(v/v)]-тай харьцуулан ялгаж авна. Стандарт электрошүршигч ионжуулалтын эх үүсвэр болон анхдагч параметрүүдийг 60 минутаас дээш хугацаанд ашиглан массын спектрометр нь 100-2750 м/з (масс-цэнэг харьцаа)-ыг авдаг. ExPASy биоинформатикийн нөөцийн портал FindPept хэрэгслийн (https://web.expasy.org/findpept/) тусламжтайгаар массын спектрийг цогцолборын дэд нэгжүүдтэй холбоно уу.
Эсүүдийг 100 мл NF-бага (10μMm-2 s-1), дунд (30μMm-2 s-1) эсвэл өндөр (300μMm-2 s-1) гэрэлд 72 цагийн турш ургуулсан. M22 орчин (аммонийн сульфатыг оруулаагүй, натрийн сукцинатыг натрийн ацетатаар сольсон M22 орчин)-ыг 100 мл-ийн шурагтай саванд (23) хийсэн. Таван 30 секундын циклд 0.1 микрон шилэн бөмбөлгийг 1:1 эзлэхүүний харьцаатайгаар бөмбөлөглөж, эсийг лизис болгож, мөсөн дээр 5 минут хөргөсөн. Уусдаггүй бодис, хугараагүй эсүүд болон шилэн бөмбөлгүүдийг ширээний микроцентрифугт 16,000 RCF-д 10 минутын турш центрифугээр зайлуулсан. Мембраныг Ti 70.1 роторт 100,000 RCF ашиглан 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) уусмалд 40/15% (w/w) сахарозын градиенттайгаар 10 цагийн турш тусгаарласан.
Өмнөх ажилд дурдсанчлан, PufW (16) дээрх His шошгыг дархлаа илрүүлэх. Товчхондоо, цэвэршүүлсэн цөм цогцолбор (11.8 нМ) эсвэл ижил концентрацитай RC агуулсан мембраныг (исэлдэлтийг бууруулсан зөрүүний спектрийг хасаж, будсан гель дээрх ачааллыг тохируулах замаар тодорхойлно) 2x SDS ачааллын буферт (Merck, UK) хоёр удаа шингэлнэ. Уургуудыг 12% бис-трис NuPage гель (Thermo Fisher Scientific, UK) хуулбар дээр ялгаж авсан. RC-L дэд нэгжийг ачаалж, дүрслэхийн тулд гельийг Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK)-ээр будсан. Хоёр дахь гель дээрх уургийг дархлааны шинжилгээнд зориулж метанолоор идэвхжүүлсэн поливинилиден фтор (PVDF) мембран (Thermo Fisher Scientific, UK) руу шилжүүлсэн. PVDF мембраныг 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 болон 5% (w / v) тослоггүй хуурай сүүнд бөглөж, дараа нь HIS-ийн эсрэг анхдагч эсрэгбиетэй (1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA-д шингэлсэн эсрэгбиеийн буфер [50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl болон 0.05% (v/v) Tween-20]) 4 цагийн турш инкубацлав. Эсрэгбиеийн буферт 5 минутын турш 3 удаа угаасны дараа мембраныг тунхууны пероксидаз (Sigma-Aldrich, UK) хулганы эсрэг хоёрдогч эсрэгбиетэй (эсрэгбиеийн буферт 1:10,000 харьцаатай шингэлсэн) нэгтгэсэн. WESTAR ETA C 2.0 хемилюминесценцийн субстрат (Cyanagen, Итали) болон Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK) ашиглан илрүүлэхийн тулд (эсрэгбиеийн буферт 3 удаа угаасны дараа 5 минутын дараа) өсгөвөрлөв.
ImageJ (57)-д будсан гель эсвэл иммуноферментийн шинжилгээний зурвас бүрийн эрчимшлийн тархалтыг зурж, оргил доорх талбайг нэгтгэн, RC-L (будсан гель) болон Protein-W (иммуноферментийн шинжилгээ)-ийн эрчимшлийн харьцааг тооцоолсноор зургийг боловсруулна. Эдгээр харьцааг цэвэр RC-LH114-W дээжинд RC-L-ийн уураг-W-ийн харьцаа 1:1 гэж үзээд өгөгдлийн багцыг бүхэлд нь хэвийн болгосноор молийн харьцаа болгон хөрвүүлэв.
Энэ нийтлэлийн нэмэлт материалыг http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 хаягаар орж үзнэ үү.
Энэ бол Creative Commons Attribution License-ийн нөхцлийн дагуу тараагдсан нээлттэй хандалтын нийтлэл юм. Анхны бүтээлийг зохих ёсоор иш татсан тохиолдолд уг нийтлэлийг ямар ч хэрэгслээр хязгаарлалтгүйгээр ашиглах, түгээх, хуулбарлахыг зөвшөөрнө.
Тэмдэглэл: Бид танаас зөвхөн имэйл хаягаа өгөхийг хүсэж байгаа бөгөөд ингэснээр таны хуудсанд санал болгож буй хүн та имэйлийг харахыг хүсч байгаа бөгөөд энэ нь спам биш гэдгийг мэдэх болно. Бид ямар ч имэйл хаягийг авахгүй.
Энэ асуултыг та зочин эсэхийг шалгах, мөн автоматаар спам илгээхээс урьдчилан сэргийлэхэд ашигладаг.
Дэвид Ж.К. Свейнсбери, Парк Чиан, Филип Ж. Жексон, Кэйтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нийл А. Рансон, Даниел П. Каннифф, Марк Ж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нийл Хантер
Урвалын төв дэх гэрлийн урхи 1 цогцолборын өндөр нарийвчлалтай бүтэц нь хиноны динамикийн талаар шинэ ойлголтыг өгдөг.
Дэвид Ж.К. Свейнсбери, Парк Чиан, Филип Ж. Жексон, Кэйтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нийл А. Рансон, Даниел П. Каннифф, Марк Ж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нийл Хантер
Урвалын төв дэх гэрлийн урхи 1 цогцолборын өндөр нарийвчлалтай бүтэц нь хиноны динамикийн талаар шинэ ойлголтыг өгдөг.
©2021 Америкийн шинжлэх ухааны дэвшлийн нийгэмлэг. бүх эрх хуулиар хамгаалагдсан. AAAS нь HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef, COUNTER хамтлагуудын түнш юм. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.